研究背景蟾酥是具有应用和开发前景的一味中药,其药理作用明确,但因其所含成分复杂,作用机制多样,主要有效成分蟾酥配基已明确具有心脏毒性,导致其在临床使用时安全剂量范围较小,在临床应用中屡有中毒、过敏等报道,其中以心血管不良事件发生率较高,这很大程度的限制了蟾酥作为药物使用的开发与临床应用。蟾酥的心脏毒性可能与其药理活性成分蟾蜍甾烯类物质化学成分结构与洋地黄类似有极大关系。作为蟾酥主要有效成分成分之一的华蟾毒精,其功效被逐一阐明,临床具有多方面的功效而极具作为新药开发的价值,目前研究主要集中在其强心作用、抗肿瘤及麻醉镇痛作用等药理作用,而其毒理作用、毒代动力学及其在体内的分布、吸收、代谢等研究相对较缺乏。如何减轻其毒性作用,发挥最大药用价值值得我们深入探讨研究。研究目的华蟾毒精与蟾酥具有相似的药理活性,因此具有作为新药开发的价值。本实验通过提取原代心肌细胞构建体外实验模型,观察华蟾毒精对原代心肌细胞是否具有毒性,以及从自噬及凋亡角度探讨华蟾毒精对心脏的毒性作用及其相关机制。研究方法1.采用断头法取乳鼠心脏,双酶消化法合并差速贴壁法获取纯度较高的原代心肌细胞,台盼蓝染色检测细胞存活率。显微镜下观察并记录细胞生长状态及搏动次数,采用MTT法对心肌细胞进行生长曲线检测,免疫荧光法鉴定心肌细胞纯度。2.华蟾毒精作用心肌细胞一定时间,采用MTT法检测心肌细胞存活率;HE法观察心肌细胞形态变化;DAPI荧光染色检测观察细胞凋亡情况;荧光探针JC-1检测细胞凋亡线粒体膜电位变化;Western Blot法检测Bcl-2蛋白表达。3.MDC染色及吖啶橙染色检测华蟾毒精对酸性自噬泡的生成的影响;Western Blot法检测LC3蛋白在华蟾毒精作用不同时间及不同浓度的表达;MTT法检测自噬抑制剂对心肌细胞活性的影响。研究结果1.原代心肌细胞的分离与培养分离的原代心肌细胞存活率约为70%-85%,原代心肌细胞占总细胞比例较大且呈多种不规则形态。培养12h后可观察到细胞贴壁;36h后细胞出现不规则搏动;48h细胞相互交联呈簇状,细胞搏动增多;72h后簇团细胞搏动一致,以50-110次/min搏动。2.华蟾毒精诱导心肌细胞凋亡用不同浓度华蟾毒精处理原代心肌细胞24h,显微镜下可观察到随着浓度增大,细胞死亡数量增多,细胞出现空泡及变形;HE染色可观察到细胞核出现碎裂及皱缩;MTT结果表明,一定浓度的华蟾毒精可降低原代心肌细胞存活率。DAPI染色可观察到15μM浓度以上华蟾毒精处理的原代心肌细胞出现核裂解,可见凋亡小体的形成。线粒体膜电位检测可见华蟾毒精处理组心肌细胞红橙色荧光明显强于空白组。Western blot法结果显示抗凋亡蛋白Bcl-2表达较空白组表达下调(P<0.01)。3.华蟾毒精诱导心肌细胞自噬AO及MDC染色结果提示,华蟾毒精可诱导原代心肌细胞酸性自噬泡及自噬溶酶体生成增加,Western blot法结果显示自噬关键蛋白LC3II蛋白表达上调,且在4小时上调达到高峰(P<0.05),随后表达下调;华蟾毒精诱导原代心肌细胞发生自噬的程度也随浓度增大而增大。研究结论综上所述,华蟾毒精对原代心肌细胞具有毒性作用,其毒性作用呈浓度依赖性,即小浓度无明显作用,较大浓度则降低细胞存活率,抑制细胞增殖。华蟾毒精可通过线粒体途径诱导原代心肌细胞发生凋亡,在表现出心脏毒性作用时可诱导心肌细胞自噬的发生。华蟾毒精在体外水平表现出了潜在的心脏毒性。