中国是全球糖尿病患者最多的国家,总量高达1.1亿,其中1型糖尿病（T1D）总数接近千万,在20年内增加将近4倍。治疗T1D最理想的方法是针对该疾病的发病机制来预防和逆转T1D。近年来已开展了免疫调节药物和细胞治疗等多项免疫干预试验,希望通过阻断自身免疫攻击,达到预防T1D的发生或缓解T1D患者症状的目的。有报道显示,T1D患者T细胞上Tfh细胞相关基因显著上调,并且患者血清中sOX40和sOX40L的表达也明显增加,表明OX40和Tfh可能参与T1D的发生,但是关于两者之间如何调控从而影响T1D的进程尚无报道。因此本研究以NOD小鼠构建T1D模型,以OX40/OX40L共刺激分子和Tfh细胞为研究对象,旨在探究OX40/OX40L信号是否通过影响Tfh细胞介导T1D的发生,以期寻找一种有效的糖尿病免疫干预方式,为T1D的预防和治疗提供实验依据。论文第一部分采用HE染色检测不同周龄NOD小鼠和对照小鼠胰岛组织的病理变化,采用流式细胞术检测T1D小鼠脾脏和胰腺淋巴结中Tfh细胞及其上OX40、APCs上OX40L分子的表达情况,并检测不同周龄NOD小鼠脾脏和胰腺淋巴结中Tfh细胞及其上CXCR4的动态变化,分析T1D的发生发展过程中B细胞、Tfh细胞及其上OX40表达水平的变化,探究Tfh细胞和OX40信号对该病免疫病理进程的影响。研究结果显示:（1）与对照小鼠相比,NOD小鼠胰岛组织淋巴细胞浸润程度相对严重,且随周龄增加浸润程度逐渐加重,发生T1D的小鼠胰岛组织几乎被淋巴完全细胞浸润,胰岛破坏明显。（2）不同周龄NOD小鼠脾脏中Tfh细胞、成熟Tfh细胞、GC Tfh细胞以及胰腺淋巴结中Tfh细胞比例与同周龄对照小鼠相比明显升高,且随周龄增加而增加,差异具有统计学意义（p＜0.05）,而未成熟Tfh细胞比例在低周龄NOD小鼠中就接近高位。（3）T1D小鼠脾脏中不同分化状态的Tfh细胞和胰腺淋巴结中Tfh细胞比例显著高于未发病小鼠,且以成熟Tfh和GC-Tfh细胞为主,差异具有统计学意义（p＜0.05）,但未成熟Tfh细胞比例两组没有差异。（4）T1D小鼠效应T细胞、Tfh细胞上OX40的表达水平明显高于对照小鼠及未发病NOD小鼠,并且成熟Tfh细胞上OX40的表达水平比未成熟Tfh细胞更高,差异具有统计学意义（p＜0.05）。（5）NOD小鼠脾脏和胰腺淋巴结Tfh细胞上CXCR4表达水平随周龄增加而递增,差异具有统计学意义（p＜0.05）。（6）T1D小鼠脾脏和胰腺淋巴结中浆细胞以及胰腺淋巴结中GC-B细胞比例高于未发病NOD小鼠和对照小鼠,差异具有统计学意义（p＜0.05）。（7）与未发病和对照小鼠相比,T1D小鼠脾脏和胰腺淋巴结中B细胞和DCs上OX40L的表达水平明显上调,差异具有统计学意义（p＜0.05）。论文第二部分利用免疫磁珠分选法、流式细胞术等方法体外分析OX40/OX40L信号对Tfh细胞分化、增殖和功能的影响,并通过体内阻断OX40/OX40L信号探究该信号通过影响Tfh细胞参与T1D疾病发展的具体机制。研究结果显示:（1）与阴性对照相比,加入sOX40L激发后,Tfh细胞上Bcl-6、IL-21、Ki67的表达水平明显上调,与阳性对照rm IL-6作用相似,当sOX40L与rmIL-6联合刺激后,Bcl-6、IL-21、Ki67的表达水平进一步提高,差异具有统计学意义（p＜0.05）。（2）与不加sOX40L对比,加入sOX40L激发后,Tfh细胞中凋亡细胞比例显著下调,并且与rmIL-6联合作用后,Tfh细胞凋亡比例更低,差异具有统计学意义（p＜0.05）。（3）Tfh细胞与B细胞进行共培养,当加入sOX40L激发后,浆细胞比例明显提高,而加入阻断型Anti-OX40L单抗后,浆细胞比例显著降低,差异具有统计学意义（p＜0.05）。（4）与对照组相比,12w NOD小鼠体内注射阻断型Anti-OX40L抗体治疗后,Tfh细胞、GC-B细胞、浆细胞比例及Tfh分泌的IL-21、IL-17水平均下调,NOD小鼠T1D发病率下降,即使发病小鼠,抗体治疗组小鼠Tfh细胞、GC-B细胞、浆细胞比例及Tfh分泌的IL-21、IL-17水平也低于对照组,差异具有统计学意义（p＜0.01）。综上,NOD小鼠胰岛组织淋巴细胞浸润程度随周龄增长而逐渐加重,发生T1D小鼠最严重,符合1型糖尿病胰岛特征。NOD小鼠疾病发展早期就已经开始往Tfh细胞方向分化,并随周龄增长不断分化成熟并极化,发病小鼠中以成熟Tfh和GC-Tfh细胞为主,因此,1型糖尿病的发生发展可能依赖于Tfh细胞的作用,特别是成熟和GC-Tfh细胞在致病中发挥关键效应。同时,T1D小鼠浆细胞、GC-B细胞比例也明显升高,提示上调的Tfh细胞可能促进了 B细胞的分化。另外,T1D小鼠Tfh细胞上OX40表达水平上调,且主要表达在成熟Tfh细胞上,提示OX40可能促进Tfh细胞的分化成熟。T1D小鼠中DCs和B细胞上OX40L的表达水平也高于未发病NOD小鼠,因此,APCs上的OX40L与Tfh细胞上的OX40相互作用,可能有助于Tfh细胞增强辅助B细胞的功能,进而产生自身抗体,介导T1D疾病的发生与发展。与此同时,NOD小鼠脾脏和胰腺淋巴结中Tfh细胞上CXCR4的表达水平也随周龄增长而逐渐提高,可能促进了 Tfh细胞的迁移。体外实验显示,OX40/OX40L信号不但能够上调Tfh细胞上Bcl-6、IL-21、的表达,促进Tfh增值,还能抑制其凋亡;不仅如此,OX40/OX40L信号还可以增强Tfh辅助B细胞分化成浆细胞的功能,阻断该信号后浆细胞的分化被抑制,说明OX40/OX40L双向信号即既能直接作用于B细胞又能通过增强Tfh细胞功能进而间接影响B细胞分化。体内阻断OX40/OX40L信号后显著减少了 Tfh细胞和浆细胞比例,降低了 NOD小鼠T1D发病率,即使是已发病的小鼠,治疗组也能明显减轻其免疫病理进程。其机制可能是在下调OX40/OX40L信号作用后,Tfh细胞分化受到抑制、活性降低,导致辅助B细胞的功能被减弱,自身抗体分泌减少,从而降低了 T1D的发病率。因此,OX40/OX40L信号可能通过放大Tfh细胞效应而导致自身抗体大量产生,进而参与T1D的发生发展。