犬流感病毒（Canine influenza virus,CIV）为A型流感病毒,属于正粘病毒科,流感病毒属的成员。现在犬群中稳定流行的主要有马源H3N8亚型CIV和禽源H3N2亚型CIV。CIV感染犬后,能引起犬只体温升高、咳嗽流涕、精神沉郁及食量减少等临床症状,严重的患犬会产生继发感染并最终导致死亡。随着宠物数量的增多,伴侣动物与人类接触的机会也不断增加,犬作为流感病毒可能的“天然混合器”,感染流感病毒后将成为影响人类健康的潜在威胁。因此,CIV的研究对公共卫生有着十分重要的意义。目前,CIV在活细胞上或动物体内的准确定位及其感染宿主后的动态追踪方面的研究尚为空白,究其原因是尚未有一种遗传稳定、易于表达,同时有标记追踪功能的重组病毒问世。绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）在Ca2+催化作用下,受395 nm紫光或470 nm蓝光激发后,能发出波长为510 nm的绿色荧光。该作用既不需要酶的参与,也不需作用底物,发光蛋白对细胞无毒性,且结构稳定,作用持久,并且能够在细胞内部被直接检测。因此,使用GFP实现病毒在宿主或活细胞中的准确定位以及追踪病毒感染后的动态过程在病毒临床研究中有广泛的应用前景,但目前仍未有将GFP标记应用于CIV的报道。本研究通过在CIV H3N2的NS片段中插入GFP基因,并在NS片段第6位剪接供体位点和第504位剪接受体位点分别引入了沉默突变以防止NS片段m RNA的剪接,同时通过引入口蹄疫病毒2A自身蛋白水解切割位点,修饰NS片段可以表达NS1-GFP和NEP为单个多蛋白,最后使用8质粒反向遗传系统拯救CIV-GFP病毒。结果表明,重组病毒CIV-GFP能够感染MDCK细胞并表达GFP,且在HA效价、EID50和TCID50等体外生物学特性上与原毒CIV并无显著差异,在MDCK细胞上的生长曲线也基本拟合原毒的变化趋势。虽然CIV-GFP在感染MDCK细胞的多周期复制过程中会出现GFP逐渐丢失的情况,但本研究发现感染MDCK细胞传至第4代仍有近10%的病毒群体为GFP阳性,因此认为CIV-GFP病毒可以在初始的几代完成对病毒的标记。重组病毒感染BALB/c小鼠后其临床症状符合CIV感染小鼠后的特征,肺脏组织冷冻切片可见荧光标记,肺部成像可以明显观察到高水平荧光。综上所述,本实验成功拯救了携带GFP基因的犬流感病毒CIV-GFP,其在体内和体外的病毒生物学特性与原毒相比无显著差异,感染MDCK细胞和BALB/c小鼠后GFP基因能稳定表达,在一定程度上起到追踪和标记病毒的作用。本研究为CIV H3N2的基础研究和致病性研究提供方法和材料,为CIV疫苗的开发提供一定的基础。