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上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)是上皮样细胞向间充质样细胞转变的过程,是一个中间态的变化,现已被证明在癌症发生、组织愈合以及iPS诱导过程中起着十分重要的作用。在iPS诱导过程中,主要发生的是EMT的逆过程,即成纤维样细胞-上皮样细胞的转化(MET),在这一过程中,会逐渐失去成纤维的细胞形态,转变为连接更为紧密的上皮细胞形态,且能表达简单上皮细胞的特异性标志物KRT18、KRT8、KRT19等。KRT18作为中间丝蛋白中的简单上皮蛋白,在癌症和早期胚胎发育与着床以及iPS诱导过程MET发生中起着标志性的作用,因此研究这一基因在胚胎发育与iPS诱导中的作用,对其在基础功能上的研究具有重要意义。本研究以实验室前期构建的pKlrkt打靶载体为基础载体,分别用PCR的方法从胎牛成纤维细胞基因组中获得包含有该基因启动区的5`同源臂和3`同源臂,以酶切连接的方法将两个同源臂连在基础载体的MluI和NheI两个位点,再对td-Tomato质粒进行BamHI和NotI双酶切,回收片段与连接好两个同源臂的pKlrkta载体进行连接,获得内含td-Tomato序列且无启动子的pTKlrkt打靶载体,通过电转染的方式将pTKlrkt打靶载体与实验室前期构建完成的CRISPR/Cas9表达质粒,以200V、5 ms、电击2次的条件共转染到胎牛成纤维细胞中,先经G418筛选后,分别以流式细胞分选和口吸管挑取的方式分选单克隆细胞,最终获得122株单克隆细胞,经跨臂PCR验证后,确定3株细胞具有正确整合,命名为BFF-KRT18-Tomato,打靶效率为2.46%,3株打靶细胞系均保持原始成纤维细胞的生长速率,能在体外正常传代5代以上。为研究iPS诱导过程中KRT18在不同转染体系和培养条件所表现出的特征,我们以获得的BFF-KRT18-Tomato打靶细胞系为初始诱导细胞,用慢病毒转染的方法分别将人源Oct4、Klf4、Sox2、C-Myc(h-OKSM)、人源Oct4、Klf4、Sox2、C-Myc、Nanog(h-OKSMN)和人源Oct4、Klf4、Sox2、C-Myc、Nanog、Lin28A(h-OKSMNL)导入打靶细胞系中,同时在CTFR培养体系(MTeSR E6、Low fatty acid BSA、rhFGF-2和IWR-1)和LCDM培养体系(DMEM/F12、Neurobasal、N-2、B27、L-Glutamine、NEAA、KSR、β-巯基乙醇、bLIF、CHIR-99021、DiM和MiN)进行培养,收集D18的细胞样品进行RT-PCR以及在荧光显微镜下观察显示,h-OKSMNL转染体系下更能促进成纤维向上皮样细胞的转变,而且两种培养体系都无法形成细胞克隆,表明均不适于biPS的诱导,但CTFR培养体系能更好的维持细胞的生长状态,同时经历向iPS诱导过程的中间上皮样形态,从而激发红色荧光蛋白的表达。综上所述,利用CRISPR/Cas9的方法可以将td-Tomato定点整合在牛胎儿成纤维细胞的KRT18的基因位点,建立的细胞系能够在MET研究中更好的起到标记作用,对研究KRT18基因的功能和iPS诱导过程提供了一个有力的工具。