目的：　　探讨艾灸调控A20对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导克罗恩病(CD)模型大鼠结肠上皮紧密连接途径(TNF-α/NF-κB-MLCK)的作用机制。　　方法：　　实验一:将40只SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、隔药灸组、西药组。采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)制备大鼠CD模型。隔药灸组选取天枢（双）、气海行隔药灸治疗，西药组采用美沙拉嗪溶液灌胃治疗，模型组与正常组只做相同的固定，不做任何治疗。治疗结束后取各组结肠上皮组织进行分离、纯化和培养建立体外肠上皮细胞屏障，将100ng/ml TNF-α分别与各组大鼠结肠上皮细胞进行体外培养24h，采用透射电镜观察各组大鼠结肠上皮屏障超微结构;Western blot法检测各组结肠上皮TNF-α/NF-κB-MLCK途径上蛋白NF-κBp65、MLCK、MLC、TRAF6、RIP1、A20的表达;免疫荧光法检测各组结肠上皮紧密连接蛋白occludin、claudin、ZO-1以及周围肌动蛋白F-actin的表达。　　实验二:WT型和A20KO型C57BL/6小鼠各40只，随机分为正常组、模型组、隔药灸组、西药组。使用2，4，6-三硝基苯磺酸分别制备WT型和A20KO型的CD小鼠模型。隔药灸组选取天枢（双）、气海行隔药灸治疗，西药组采用美沙拉嗪溶液灌胃治疗，模型组与正常组只做相同的固定，不做任何治疗。采用结肠组织肉眼评分和ELISA检测外周血清FITC-Dextran(4KD)水平评价各组结肠上皮屏障通透性。Western blot法检测各组小鼠结肠上皮TNF-α/NF-κB-MLCK途径中的蛋白NF-κBp65、MLCK、MLC、TRAF6、RIP1的表达;免疫荧光法检测各组肠上皮紧密连接蛋白occludin、 claudin、ZO-1以及周围肌动蛋白F-actin的表达。　　结果：　　实验一:透射电镜观察结果显示，正常组大鼠结肠上皮细胞核较大，细胞器结构较完整。正常+TNF-α组肠上皮细胞核较大，不规则;细胞器结构部分破坏。模型+TNF-α组肠上皮细胞核凝聚，核不规则;细胞器结构破坏，细胞器有缺失。隔药灸+TNF-α组肠上皮细胞核部分凝聚，部分核染色质较均匀，核不规则，细胞器结构部分破坏。西药+TNF-α组肠上皮细胞核部分凝聚，核不规则、细胞器结构部分破坏，线粒体破坏，胞浆内有大量空泡。　　Western blot法检测各组结肠上皮TNF-α/NF-κB-MLCK途径中蛋白NF-κ Bp65、MLCK、MLC、TRAF6、RIP1、A20的表达结果显示，与正常+TNF-α组比较，模型+TNF-α组的NF-κBp65、MLCK、MLC、TRAF6、RIP1表达量明显升高（P均＜0.01）;与模型+TNF-α组比较，隔药灸+TNF-α组的NF-κBp65、MLCK、MLC、TRAF6表达量则有明显降低（P均＜0.01），RIP1表达量也有降低(P＜0.05），提示艾灸（隔药灸）可下调结肠上皮TNF-α/NF-κB-MLCK途径中NF-κB p65、MLCK、MLC、TRAF6、RIP1的表达。　　与正常+TNF-α组比较，模型+TNF-α组的A20表达量明显降低(P＜0.01）;与模型+TNF-α组比较，隔药灸+TNF-α组的A20表达量则有明显升高(P均＜0.01）。提示艾灸（隔药灸）可上调结肠上皮A20的表达。　　免疫荧光激光共聚焦法检测结肠上皮紧密连接蛋白occludin、claudin、ZO-1以及周围肌动蛋白F-actin的表达结果显示，与模型+TNF-α组比较，隔药灸+TNF-α组的occludin、claudin、ZO-1、F-actin表达量则有明显升高（P均＜0.01），提示艾灸（隔药灸）可通过上调紧密蛋白claudin、occludin、ZO-1及肌动蛋白F-actin的表达来改善肠上皮屏障的通透性。　　实验二:结肠组织损伤肉眼评分结果显示，WT型和A20KO型，与模型组比较，隔药灸组肉眼评分均有明显的下降（P均＜0.05），提示不论是WT型还是A20KO型，艾灸（隔药灸）均能改善CD模型肠黏膜组织损伤状况。　　FITC-Dextran(4KD)荧光探针检测各组肠上皮通透性结果显示，A20KO型，与模型组比较，隔药灸组中外周血清FITC-Dextran(4KD)的浓度有明显降低(P＜0.01)。与WT型比较，A20KO型小鼠模型组外周血清FITC-Dextran(4KD)的浓度升高(P＜0.05);与WT型比较，A20KO型小鼠隔药灸组外周血清FITC-Dextran(4KD)的浓度升高（P＜0.05）。　　Western blot检测TNF-α/NF-κB-MLCK途径中的NF-κBp65、MLCK、MLC结果显示:A20KO型，与模型组比较，隔药灸组的NF-κBp65、MLCK、MLC的表达明显降低（P均＜0.01）。与WT型比较，A20KO型小鼠模型组NF-κBp65、MLCK、MLC的表达有升高(P＜0.05;P＜0.01;P＜0.01);与WT型比较，A20KO型小鼠隔药灸组NF-κBp65的表达升高(P＜0.05)。　　Western blot检测TNF-α/NF-κB-MLCK途径中信号分子TRAF6、RIP1结果提示:　　A20KO型，与模型组比较，隔药灸组TRAF6、RIP1的的表达明显降低(P均＜0.01)。与WT型比较，A20KO型小鼠模型组TRAF6的表达有升高(P＜0.01);与WT型比较，A20KO型小鼠隔药灸组TRAF6的表达有升高(P＜0.05)。而RIP1蛋白表达在WT型与A20KO型间无统计差异。　　免疫荧光激光共聚焦法检测结肠上皮紧密连接蛋白occludin、claudin、ZO-1以及周围肌动蛋白F-actin的表达结果显示，A20KO型隔药灸组与WT型隔药灸组比较，occludin、claudin、ZO-1的表达降低(P＜0.05;P＜0.01;P＜0.01)，A20KO型模型组与WT型模型组比较，occludin、claudin、ZO-1、F-actin的表达降低(P＜0.05;P＜0.01;P＜0.01;P＜0.05)。　　结论：　　1、证实TNF-α介导的NF-κB-MLCK紧密连接途径的异常可导致CD肠上皮屏障通透性增加。2、条件性肠上皮A20基因缺陷（敲除）小鼠对炎症的敏感性异常增高，易发生严重的CD肠道炎症反应。3、初步阐明艾灸（隔药灸）的作用机制之一是通过促进A20表达来负反馈NF-κB的活性，进而影响TNF-α介导的NF-κB-MLCK紧密连接途径的异常，由此改善肠上皮屏障的通透性。4、初步认为TRAF6可能是艾灸（隔药灸）介导A20负调控NF-κB活性通路中的重要信号分子。