柑橘脉突病毒(Citrus vein enation virus,CVEV)是黄矮病毒科(Luteoviridae)豌豆耳突花叶病毒属(Enamovirus)的一种正义单链RNA病毒,引起柑橘脉突病及木瘤病。目前,CVEV在西班牙、南非、澳大利亚、巴西、印度、美国、秘鲁和土耳其等多个国家均有发生,在我国主要分布于浙江黄岩地区。由于该病毒能由多种蚜虫传播,因而具有一定的传播流行风险。为保障我国柑橘产业安全,本研究在建立CVEV实时荧光定量RT-PCR检测方法的基础上,构建CVEV全长cDNA克隆,分析其侵染性,并开展了CVEV基因沉默抑制子的鉴定,以期为CVEV的流行监控、分子生物学及致病机理研究奠定基础。所取得的主要研究结果如下:1.CVEV实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立本研究通过设计特异性引物(EVqF4/EVqR4),优化反应条件,建立了CVEV实时荧光定量RT-PCR检测体系。该方法特异性良好;灵敏度较高(为常规RT-PCR的100倍);标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.992,扩增效率为101.8%;检测组间和组内变异系数均不超过2.85%,重复性较好,适用于检测田间样品。2.CVEV在代代酸橙植株中的时空分布应用所建立的实时荧光定量RT-PCR检测体系对CVEV在代代酸橙中的时空分布进行检测。结果表明,CVEV在代代酸橙根中,无论春季、夏季或者秋季,其含量相对于其它部位最高,其次是嫩皮;另外,嫩叶、嫩皮和老皮中CVEV含量在春季最高,春、夏、秋依次减少。3.构建CVEV全长cDNA克隆及其序列分析本研究建立了CVEV全基因组一步法RT-PCR扩增体系,并成功获得其全长cDNA克隆36个。序列比对结果显示,本研究所获CVEV全长基因组序列(命名为CVEV-XSH)与已报道的VE-1分离株基因组序列相似度最高,为98.61%;与豌豆耳突花叶病毒-1(Pea enation mosaic virus-1,PEMV-1)和紫花苜蓿耳突病毒(Alfalfa enamovirus-1,AEV)曼菲蒂分离株序列进行比对,其一致性分别为90.46%和90.26%,表明CVEV-XSH基因序列相对保守。根据全基因组序列构建的进化树显示,CVEV-XSH与VE-1、PEMV-1、AEV曼菲蒂分离株聚为一簇,与序列相似性分析结果一致。4.CVEV全长cDNA克隆侵染性分析采用农杆菌介导的本生烟接种法,对获得的36个CVEV全长cDNA克隆进行了侵染实验。生物学观察以及分子检测结果显示未获得侵染性克隆。为此,本研究进一步设计实验,旨在发掘影响其侵染性的因素。首先,利用5’Race技术获得末端序列,并对其变异情况进行分析;结果显示,CVEV 5’端序列保守性极高,未发现变异存在。其次,采用与CVEV全长cDNA克隆相同的方法构建PVX全长cDNA克隆,成功获得PVX全长cDNA侵染性克隆,说明本研究所用双元表达载体pXT1以及构建方法均有效。第三,为避免重组质粒在大肠杆菌中存在不稳定现象而造成侵染失败问题,本研究将CVEV全长基因PCR产物与表达载体pXT1连接后,直接转化农杆菌初步得到4个阳性克隆,接种后经分子检测仍未筛选出侵染性克隆。第四,筛选其它草本寄主,即采用毒源叶片汁液摩擦接种豌豆、蚕豆、芸豆、昆诺藜等草本植株,结果显示均未表现出侵染性。综上表明,CVEV全长cDNA克隆侵染失败并非5’末端序列变异、表达载体以及构建方法所致,而针对重组质粒在大肠杆菌中不稳定以及寄主影响,或者其它原因造成的侵染失败,还需进一步分析探究。5.CVEV基因沉默抑制子的初步鉴定本研究在克隆CVEV 5个开放阅读框(Open reading frame,ORF)编码基因的基础上,构建其重组双元表达载体,并利用农杆菌介导的病毒微型复制子(p35miniBYV-eGFP)共浸润鉴定法开展了沉默抑制子鉴定试验。结果显示:CP表达载体共注射本生烟植株各重复均出现绿色荧光,其荧光强度较负对照强,但与正对照HC-Pro相比较弱,说明CP具有一定的基因沉默抑制作用。其它ORF表达载体共注射植株与负对照相比无明显差异;进一步经实时荧光定量RT-PCR检测结果显示,CP表达载体共注射本生烟叶片中GFP相对表达量高于负对照1倍左右,低于正对照,其它基因与负对照相比表达差异不大,CP可初步认定为弱抑制子。