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1.5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(1,5-bisphosphate ribulose carboxylase/oxygenase,Rubisco)是高等植物在光合碳代谢中的关键酶,是植物中最显著受光诱导表达的基因之一。本研究以天山雪莲(S. involucrata Kar. et Kir.)为材料,根据本实验室从天山雪莲中克隆的Rubisco的小亚基SikrbcS2的基因组序列设计引物,分别通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)和高效TAIL-PCR(hiTAIL-PCR)扩增SikrbcS25′侧翼序列。经生物信息学分析,SikrbcS2启动子片段长1668bp。用生物学软件PLACE和PlantCare分析表明,该序列具有启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box,包含多个胁迫诱导元件,如光诱导元件、赤霉素、低温诱导元件、逆境应答相关元件、昼夜节律调控元件等。 在本研究中,为了分析SikrbcS2启动子的功能,根据SikrbcS2启动子序列所具有的相关功能元件,对天山雪莲幼苗进行不同光照条件的处理,以及低温、干旱和盐胁迫。采用实时荧光定量PCR分析不同处理中的SikrbcS2基因的相对表达量。 结果显示:SikrbcS2的表达量受光的诱导,并响应低温、干旱和盐胁迫。为了进一步确定SikrbcS2启动子的表达特性,构建pBI121-PSikrbcS2-GUS植物表达载体,转化农杆菌,利用浸花法获得转基因拟南芥。PCR及RT-PCR鉴定转基因植株。对转SikrbcS2基因拟南芥的植株GUS染色后发现,该启动子能在叶片中特异表达,说明其是一个在叶的组织中表达的和受光诱导的特异性启动子。 为了研究SikrbcS2基因的抗寒性,我们对转SikrbcS2基因烟草及野生型烟草进行低温胁迫处理。结果表明:(1)组成型表达的转SikrbcS2基因烟草与野生型烟草植株相比,随着温度的不断降低,其相对电导率和丙二醛含量升高的慢, PSⅡ最大光化学效率下降的慢。-2℃处理下,野生型烟草和转基因烟草的叶片都出现冻害状态,但野生型烟草叶片冻害程度远大于转基因型烟草。室温进行恢复5天后,发现3个株系中有2个株系恢复快且较好,株系间的抗寒性表现出不同,这可能是因为SikrbcS2基因插入到了烟草基因组的不同位置上,导致基因的表达量有所不同;(2)构建植物表达载PSikrbcS2-SikrbcS2-2301,利用农杆菌介导法转化烟草,获得转基因植株,PCR及RT-PCR鉴定转基因植株。-2℃处理下, SikrbcS2启动子调控的转 SikrbcS2基因烟草与空白烟草相比,野生型烟草的丙二醛含量明显比转基因烟草的要高,电导率的变化趋势与丙二醛含量的变化一致,转基因烟草的PSⅡ最大光化学效率下降速度要慢于野生型烟草。以上结果说明,天山雪莲SikrbcS2基因可以提高烟草的抗寒性。 为了比较转基因烟草和空白烟草在低温胁迫下Rubisco的活性,我们对转基因烟草及空白烟草进行了低温处理,并提取不同处理下的烟草植株的Rubisco粗酶液。将Rubisco粗酶液先后经35％-55%( NH4)2SO4盐析、SephadexG-25柱及DEAE-cellulose柱分离纯化,经SDS-PAGE电泳发现,纯化后的Rubisco呈两条谱带,一条是位于50-70kD之间的Rubisco大亚基,另一条是分子量大小约15kD左右的小亚基。采用分光光度计法测定Rubisco在不同温度下的活性。结果显示,与空白烟草相比,转SikrbcS2基因烟草的Rubisco在低温条件下表现出了较高的活性,也许是SikrbcS2基因在烟草的叶绿体内组装成较多的杂合Rubisco,提高了转SikrbcS2基因烟草的抗寒能力。