论文部分内容阅读
LOC401296基因是本实验室前期筛选到的一个辐射诱导基因,对其进行生物信息学分析提示该基因为一种功能未知基因。本研究实现LOC401296基因原核表达并制备LOC401296蛋白的单克隆抗体,初步证实LOC401296基因在细胞生长、周期调控方面发挥作用。 本研究首先从基本生物信息学分析、细胞表达谱、细胞内定位等三方面研究LOC401296基因基本生物学特征,然后构建该基因原核表达及真核表达载体,实现LOC401296蛋白原核表达,通过免疫小鼠制备LOC401296蛋白单克隆抗体。 生物信息学分析发现LOC401296基因定位于人7p22.3,CDS全长585bp,编码194AA;同源比对结果显示,该基因在灵长类高度同源(猕猴81％,黑猩猩96%,倭黑猩猩97%),小鼠未见同源序列;保守结构域分析未发现已知功能结构域和核定位信号。RT-PCR检测发现LOC401296 mRNA在Hela、A549、MCF7、HEK293、U937、Molt4、K562、LO2、HepG2等多种细胞中表达;利用GFP融合蛋白研究LOC401296蛋白定位,发现该蛋白在细胞核内表达,呈点状聚集状态,且与PML-Ⅳ存在共定位。采用PCR技术成功克隆LOC401296基因CDS全长序列,pET28B-LOC401296原核表达载体和pCMV-Myc-LOC401296真核表达载体构建成功,成功诱导LOC401296-6×His融合蛋白表达,纯化LOC401296-6×His蛋白免疫小鼠后经Western blot筛查获得多个抗LOC401296蛋白单克隆细胞株,其中一个克隆株用于制备腹水并纯化获得LOC401296纯化抗体,Western blot证实抗体特异性良好。研究表明LOC401296是一个广泛表达的基因,所编码蛋白定位于细胞核内PML-Ⅳ,核定位序列有待进一步分析。克隆了LOC401296基因CDS全长序列,并成功构建了该基因表达载体,分别在大肠杆菌和真核细胞内实现LOC401296蛋白表达,获得小鼠抗人LOC401296蛋白单克隆抗体,为LOC401296基因生物学功能研究奠定了良好的基础。 接下来,通过基因沉默技术下调LOC401296基因表达,从细胞生长、细胞凋亡和细胞周期三个方面探索LOC401296基因生物学功能。 首先,通过基因沉默技术下调LOC401296表达研究该基因对细胞生长的影响。采用CCK-8试剂检测增殖、流式细胞术、免疫荧光实验、Western blot等方法分析该沉默该基因表达对细胞生长、凋亡、周期及有丝分裂过程的影响。下调LOC401296表达能抑制Hela、A549、MCF7、HEK293细胞生长,下调表达后第5天细胞增殖抑制率最高达48%(HEK293)。Annexin V检测细胞凋亡,结果发现下调LOC401296表达诱导细胞凋亡发生:Hela细胞凋亡16.53%(对照组9.26%),HEK293细胞凋亡7.06%(对照组3.28%)。流式细胞术分析细胞周期及有丝分裂指数,数据显示:下调LOC401296表达诱导Hela细胞及HEK293细胞G2/M阻滞;同时标记Hela细胞中phospho-Histone H3(Ser10)检测阳性细胞比例,证明下调该基因表达后第2天及第3天,LOC401296下调组M期细胞比例较对照组明显增加。进一步通过间接免疫荧光法对细胞有丝分裂过程中纺锤体形态进行观察:发现下调LOC401296表达导致纺锤体异常(纺锤体出现偏移、不对称分布、单极、多极、缺失等多种异常形态)。Western blot分析下调LOC401296基因表达对G2/M期调控相关蛋白的影响,结果发现Plk1蛋白表达量明显降低,而CyclinB1、Cdk1、p-Cdk1无明显变化;同时间接免疫荧光法观察到下调LOC401296基因后纺锤体异常的细胞中Plk1蛋白表达也显著降低,部分纺锤体偏移的细胞内定位于中心体的Plk1蛋白消失,这提示 Plk1可能参与LOC401296对细胞有丝分裂过程的调控。但LOC401296调控有丝分裂过程的信号通路及LOC401296与Plk1的相互作用关系仍有待进一步研究。 本研究首次对功能未知基因LOC401296的功能进行研究,证实该基因编码一种核定位蛋白,在多种细胞系中广泛表达,为细胞生长所必需。研究发现,下调LOC401296表达引起细胞纺锤体形成异常,引起M期阻滞,这种生物学功能可能与调节Plk1表达有关。