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背景：肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSC）是肝纤维化的主要细胞，其激活、转化被认为是肝纤维化发病的中心事件，为细胞外基质（extracellular matrix,ECM）产生的重要来源。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH oxidase,NOX）产生活性氧（reactive oxygen species, ROS），调控HSCs内纤维化信号转导，在肝纤维化发病中起关键作用，是抗纤维化的重要靶点。NOX产生的ROS可介导丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶（phosphatidylinositol-3kinase/Akt, PI3K/Akt）信号通路激活，促进HSC增殖、抑制其凋亡，导致肝纤维化形成。我们前期体外实验发现熊果酸选择性诱导活化型HSC凋亡、抑制其增殖；瘦素可通过JAK信号通路直接激活NOX，进而产生大量ROS；而熊果酸干预能下调瘦素诱导的活化型HSC的NOX亚基Rac1和p22phoxmRNA表达、抑制NOX活性及ROS的产生，阻断ERK1/2及NF-κB活化，下调XIAP、TIMP-1和上调MMP-1基因表达。本课题在此基础上继续深入探讨熊果酸对活化型HSC的NOX其他亚基gp91phox、p22phox、p67phox、Rac1蛋白的表达，信号通路PI3K、Akt、P38MAPK活性及其产生的效应TIMP-1、MMP-1的影响，以阐明熊果酸诱导活化型HSC凋亡及抗纤维化机制。目的：观察熊果酸对大鼠活化型肝星状细胞（HSC-T6）NOX亚基、其调控的PI3K/Akt、P38MAPK信号通路及产生的效应TIMP-1、MMP-1蛋白表达的影响，并探讨其机制。方法：取对数生长期的HSC-T6细胞，随机分成六组：空白对照组、瘦素组（100ng/ml）、熊果酸干预组(熊果酸50μM+瘦素)、DPI干预组（DPI20μM+瘦素）、SB203580干预组（SB20358010μM+瘦素）、LY294002干预组（LY29400210μM+瘦素）。HSC-T6经药物作用12h后，提取总蛋白，采用Western-blotting检测NOX亚基gp91phox、p22phox、p67phox、Rac1蛋白表达；药物作用30min后，采用Western-blotting检测信号通路PI3K、Akt、P38MAPK的活化；药物作用24h后，采用Western-blotting检测TIMP-1及MMP-1蛋白表达。结果：1．熊果酸对瘦素诱导的HSC-T6细胞内NOX亚基gp91phox、p22phox、p67phox、Rac1蛋白表达的影响瘦素刺激HSC-T6细胞12h后，gp91phox、 p22phox、 p67phox、 Rac1蛋白的表达均较空白对照组显著升高（均P<0.01）；给予熊果酸干预后gp91phox、 p22phox、p67phox、 Rac1蛋白的表达均明显低于瘦素组（均P<0.01）。 NOX抑制剂DPI及PI3K抑制剂LY294002干预后gp91phox、p22phox、p67phox、Rac1蛋白的表达均低于瘦素组（均P<0.01）。熊果酸干预组的gp91phox、p67phox蛋白的表达高于DPI及LY294002干预组（P<0.05），p22phox、Rac1蛋白的表达与DPI、LY294002干预组在统计学上无显著差异（P>0.05）。上述结果表明熊果酸能抑制瘦素诱导的gp91phox、 p22phox、 p67phox、 Rac1蛋白表达。2．熊果酸对瘦素诱导的HSC-T6细胞PI3K、Akt及P38MAPK信号通路活化的影响2.1.熊果酸对瘦素诱导的HSC-T6细胞PI3K蛋白表达的影响瘦素刺激HSC-T6细胞30min后，细胞内PI3K蛋白表达较空白对照组显著升高（P<0.01）；给予熊果酸干预后PI3K蛋白的表达明显低于瘦素组（P<0.01）。DPI及LY294002干预后PI3K的表达均低于瘦素组（均P<0.01）；熊果酸干预组的PI3K蛋白的表达与DPI、LY294002干预组在统计学上无显著差异（P>0.05）。上述结果表明熊果酸可以抑制瘦素诱导的PI3K蛋白表达。2.2.熊果酸对瘦素诱导的HSC-T6细胞Akt蛋白磷酸化的影响瘦素刺激HSC-T6细胞30min后，细胞内P-Akt表达较空白对照组显著升高（P<0.01）；给予熊果酸干预后P-Akt表达明显低于瘦素组（P<0.01）。DPI及LY294002干预后P-Akt表达均低于瘦素组（均P<0.01）；熊果酸干预组的P-Akt蛋白的表达低于DPI干预组（P<0.05），与LY294002干预组在统计学上无显著差异（P>0.05）。上述结果表明熊果酸可以抑制瘦素诱导的Akt蛋白磷酸化。2.3.熊果酸对瘦素诱导的HSC-T6细胞P38MAPK蛋白磷酸化的影响瘦素刺激HSC-T6细胞30min后，细胞内p-P38MAPK表达较空白对照组显著升高（P<0.01）；给予熊果酸干预后p-P38MAPK表达明显低于瘦素组（P<0.01）。DPI、SB203580及LY294002干预后p-P38MAPK均低于瘦素组（均P<0.01）；熊果酸干预组的p-P38MAPK的表达低于SB203580及LY294002干预组（P<0.05），与DPI干预组在统计学上无显著差异（P>0.05）。上述结果表明熊果酸可以抑制瘦素诱导的P38MAPK蛋白磷酸化。3．熊果酸对瘦素诱导的HSC-T6细胞TIMP-1、MMP-1蛋白表达的影响3.1.熊果酸对瘦素诱导的HSC-T6细胞TIMP-1蛋白表达的影响瘦素刺激HSC-T6细胞24h后TIMP-1蛋白表达较空白对照组升高（P<0.05）；给予熊果酸干预后TIMP-1蛋白表达明显低于瘦素组（P<0.01）。DPI、SB203580及LY294002干预后TIMP-1蛋白表达均低于瘦素组（均P<0.01）；熊果酸干预组的TIMP-1的表达低于LY294002干预组（P<0.05），但与DPI及SB203580干预组在统计学上无显著差异（P>0.05）。上述结果表明熊果酸可以抑制瘦素诱导的TIMP-1蛋白表达。3.2.熊果酸对瘦素诱导的HSC-T6细胞MMP-1蛋白表达的影响瘦素刺激HSC-T6细胞24h后MMP-1蛋白表达较空白对照组降低（P<0.05）；熊果酸干预后MMP-1蛋白表达明显高于瘦素组（P<0.01）。分别给予DPI、SB203580及LY294002干预后MMP-1的表达均高于瘦素组（P<0.01或P<0.05）；熊果酸干预组的MMP-1的表达高于SB203580干预组（P<0.05），与DPI及LY294002干预组在统计学上无显著差异（P>0.05）。上述结果表明熊果酸可以阻断瘦素诱导的MMP-1蛋白表达下调。结论：1.熊果酸能抑制瘦素诱导的大鼠HSC-T6细胞NOX亚基gp91phox、p22phox、p67phox、Rac1表达及PI3K/Akt、P38MAPK信号通路的活化。2.熊果酸下调TIMP-1蛋白及上调MMP-1蛋白表达的机制可能与熊果酸抑制NOX调控的PI3K/Akt及P38MAPK信号通路有关。