研究背景心房颤动(atrial fibrillation,AF)是临床上最常见的心律失常之一,心房重构是AF发生、维持的重要基质。心房重构包括心房结构重构和心房电重构,心房结构重构是心房电重构发生和维持的基础。AF患者的心房重构由相关疾病和AF本身引起,高血压、心力衰竭和二尖瓣疾病患者均合并心房的血流动力学超负荷,导致心房肌细胞伸长,心房发生重构,为AF的起始提供了基质;AF发生发展之后,则将进一步加重心房重构程度。心房结构重构包括心房扩大,心房肌细胞肥大、凋亡,间质纤维化,肌溶解,线粒体异常等,在AF动物模型和AF患者心房组织活检中均已观察到。心房细胞肥大是AF最重要的结构重构特征之一,也是AF发生的主要基质。心房细胞肥大使心房内电活动传导的各向异性增大,离散程度增加,使房性心律失常易于发生。心肌细胞肥大是一种对内在或外在机械应力产生的应答性反应。生理性肥大一般发生在心脏发育和增长时期,病理性心肌肥大是由体积和压力超负荷或与力的生成、分布及收缩调控蛋白相关的编码基因突变引起。肥大主要分两种类型:心肌细胞直径增加,同心性心肌肥大,压力超负荷得到代偿;心肌细胞伸长、心肌细胞直径增加,心腔扩大,容量超负荷得以代偿。在快速心房起搏的模型中也观察到心房细胞的肥大,控制心室率情况下快速心房起搏一周并没有导致肥大,而起搏更长的时间可导致肥大。在AF患者中可观察到心房肌细胞肥大,心房细胞肥大的特点是细胞伸长,相关基因标志物如心房利钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)和肌钙蛋白T表达水平增加。在AF患者中,血浆ANP水平在AF发生后立即升高,复律后再次下降。牵张心房肌细胞后,ANP和肌钙蛋白T的合成和释放增加。炎症与AF的发生和维持密切相关,在孤立性AF患者的心房组织活检中显示有炎性浸润,血清炎症标志物水平升高。最近有研究表明,AF患者心房组织有中性粒细胞的组成成分—髓过氧化物酶的累积。有研究通过使用强的松或他汀抑制了快速起搏介导的心房重构,可能是通过两者的抗炎作用,阻止了房性心动过速导致的电生理重构和促进AF发生的作用。在压力超负荷模型中,肥大细胞在心房纤维化和增强AF可诱导性中的发挥了作用。肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis,TWEAK)是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)配体超家族的成员。TWEAK起初合成为含249个氨基结构的Ⅱ型跨膜蛋白,分子量为23kDa,在包括心脏、脑、骨骼肌、脉管系统等多种组织内表达,经内切蛋白酶降解后产生其可溶性的细胞因子形式sTWEAK。TWEAK是一种强效的致炎因子,TWEAK通常处于低水平的表达,在病理条件下,TWEAK可被诱导而表达增高。TWEAK通过与其受体成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14(fibroblast growth factor-inducible 14,Fn14)特异性结合激活下游通路,从而发挥 一系列生物学效应。Fn14为Ⅰ型跨膜蛋白,是高度可诱导的细胞表面受体,在正常组织中的表达相对较少,当发生损伤或疾病时,表达水平会明显上调。在心血管系统,TWEAK和Fn14可表达于心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和心肌成纤维细胞。Fn14是TWEAK的功能性受体,TWEAK通过与Fn14结合发挥生物学功能。Fn14胞内结构域C末端可介导依赖TWEAK的Fn14自身聚集以及NF-kB信号通路的激活。TWEAK/Fn14可通过核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路促进心肌成纤维细胞的增殖及胶原纤维合成。在大鼠原代心肌细胞中,TWEAK/Fn14的活化导致了心肌细胞肥大。TWEAK过表达的转基因小鼠表现出心肌细胞肥大和心脏扩张,Fn1 4基因敲除后没有出现TWEAK介导的心脏扩张。TWEAK主要通过激活NF-κB发挥作用,TWEAK也可以激活p44/p42丝裂原活化蛋白激酶、c-jun氨基末端激酶1、Janus激酶(Januskinase,JAK)/信号传导子及转录激活子(signal transducer and activator of transcription,STAT)等转录因子。JAK/STATs是重要的细胞因子信号转导通路,在细胞分化、增殖、发育、凋亡和炎症等中发挥着重要作用。TWEAK可通过JAK/STATs通路诱导肿瘤细胞凋亡。在肝星状细胞中,TWEAK/Fn14通过STAT3通路,上调了促炎性细胞因子的分泌。新生大鼠心肌细胞中,机械牵张诱导的基质金属蛋白酶的激活是由AngⅡ-JAK-STAT通路介导的。AngⅡ可促进心房肌细胞JAK/STAT的激活和ANP的表达。JAK/STATs通路与压力过负荷引起的心肌肥大和心脏重构有关。IL-6通过激活JAK/STATs通路参与了心肌肥大。在AF患者的心房组织中,磷酸化STAT3水平明显升高。综上所述,我们提出如下科学假说:TWEAK刺激可上调Fn14的表达,激活JAK/STAT通路,促进心房肌细胞肥大;抑制Fn14可能会对心房结构重构起到保护作用。研究目的1.研究TWEAK刺激对Fn14表达的影响;2.研究TWEAK/Fn14在HL-1心房细胞肥大中的作用及相关分子机制;2.探讨JAK/STATs通路在TWEAK/Fn14致心房细胞肥大中的作用。研究方法1.细胞培养以HL-1心房肌细胞系为研究对象,HL-1细胞是由美国路易斯安那州立大学的Claycomb教授赠与。设置TWEAK浓度梯度:0,10,50,100,200,400ng/ml,研究TWEAK刺激对心房细胞肥大的作用。2.细胞干预筛选特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),采用Lipo2000转染HL-1心房细胞,分别观察抑制Fn14、JAK2、STAT3的表达对TWEAK诱导的心房细胞肥大的影响。将细胞分为:control组、TWEAK组、TWEAK+ siRNA-NC组、TWEAK+ siRNA-Fn14 组/TWEAK+ siRNA-JAK2 组/TWEAK+ siRNA-STAT3 组。3.细胞免疫荧光染色不同刺激后的HL-1细胞,经固定、封闭后,一抗4℃孵育过夜,荧光二抗37℃避光孵育30分钟,DAPI染核,封片,荧光显微镜下观察。4.Western blotting检测收集各组细胞,提取细胞蛋白,SDS-PAGE电泳,湿转法转膜,封闭,一抗4℃孵育过夜,二抗常温孵育,化学发光,分析蛋白条带灰度值。5.统计学分析数据以均数±标准差表示,采用SPSS 17.0软件进行数据处理。两组间均数比较采用独立样本t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),p<0.05为具有统计学差异。研究结果1.TWEAK刺激上调HL-1心房肌细胞Fn14表达为明确TWEAK对心房肌细胞Fn14表达的作用,基于以前的研究,我们选择了TWEAK的系列浓度:0、10、50、100、200、400ng/ml进行刺激24小时,检测Fn14表达水平的变化。实验结果显示:与对照姐相比,TWEAK浓度在100、200、400ng/ml时,Fn14蛋白表达明显增加(p<0.05),在HL-1细胞中TWEAK刺激使HL-1心房肌细胞中Fn14的表达上调。2.TWEAK刺激诱导HL-1心房肌细胞肥大为明确TWEAK对HL-1心房肌细胞肥大相关基因的影响,给与不同浓度TWEAK刺激HL-1心房肌细胞。与对照组相比,TWEAK浓度在50、100、200、400ng/ml时,ANP表达增加(p<0.05),TWEAK浓度在 100、200、400ng/ml时,肌钙蛋白T表达增加(p<0.05)。根据以上研究结果,后续体外实验我们选用TWEAK浓度100ng/ml作为HL-1心房肌细胞的刺激条件。3.干扰Fn14表达可减弱TWEAK介导的HL-1细胞肥大为了进一步明确Fn14对心房肌细胞肥大的影响,我们使用了 Fn14特异性的siRNA干扰Fn14表达。经特异性siRNA转染后,与对照组相比,Fn14表达显著降低(p<0.05)。免疫荧光检测也显示TWEAK作用后,Fn14蛋白表达增高,siRNA干扰24小时后,Fn14表达降低(p<0.05)。TWEAK刺激显著增加HL-1心房肌细胞肥大相关基因的表达,抑制Fn14明显减弱了 ANP和肌钙蛋白T的增加(p<0.05)。干扰Fn14可减弱TWEAK诱导的HL-1心房肌细胞的肥大,Fn14在TWEAK诱导的HL-1肥大过程中起到了关键的作用。4.TWEAK介导HL-1心房肌细胞p-JAK2和p-STAT3的活化为了评估JAK/STAT通路是否与HL-1心房肌细胞TWEAK/Fn 14的激活有关,我们检测了JAK/STAT通路的磷酸化水平。TWEAK浓度为100、200、400ng/ml刺激后,p-JAK2和p-STAT3水平显著增加(p<0.05),p-JAK1、p-TYK2、p-STAT1的表达没有明显变化。5.干扰Fn 14可降低TWEAK诱导的JAK/STAT通路的磷酸化特异性siRNA干扰Fn14的表达后,有效降低了 TWEAK诱导的JAK2和STAT3磷酸化水平的表达增加(p<0.05)。6.JAK2参与介导TWEAK/Fn14促心房肌肥大作用我们进一步研究了 JAK2在TWEAK介导的心房肥大中的作用。通过特异性siRNA阻断JAK2表达(p<0.05),p-STAT3、ANP、肌钙蛋白T表达水平显著下降(p<0.05)。7.STAT3参与介导TWEAK/Fn14促心房肌肥大作用特异性siRNA干扰STAT3的表达(p<0.05)后,ANP和肌钙蛋白T表达降低(p<0.05)。TWEAK通过激活JAK2/STAT3通路上调肥大相关基因ANP和Troponin T 的表达。研究结论1.TWEAK可上调Fn 14表达,TWEAK/Fn 14的活化可介导HL-1心房肌细胞肥大相关基因的表达增加;2.JAK2/STAT3通路参与介导TWEAK/Fn14诱导的心房细胞肥大;3.干扰Fn14可能通过减轻JAK2/STAT3的活化,降低TWEAK诱导的心房细胞肥大,从而发挥抗心房结构重构的作用。研究背景心房颤动(atrial fibrillation,AF)是临床上最常见的心律失常之一,卒中是AF患者最严重的并发症。非瓣膜病性AF指AF的基础病因不存在瓣膜病变,而与高血压、冠心病、心力衰竭、心肌病、糖尿病等器质性病变有关,或者是不合并任何器质性病变的孤立性AF。非瓣膜病性AF的发病率随着人口老龄化而显著增高,同时使卒中的风险显著增加。AF患者的血栓发生率为10%-18%,其中约90%的血栓形成于左心耳(left atrial appendage,LAA)。来源于左房和LAA的血栓,与AF最为相关,占心源性栓塞的45%。与非AF相关的卒中相比,AF引起的栓塞性卒中通常更严重,致残和致死率更高,也更容易复发。AF发作时心房血流速度缓慢瘀滞,左右心房尤其是LAA内极易形成血栓,当AF持续48小时以上,经食道超声心动图(transesophageal echocardiography,TEE)检查显示,AF患者心房血栓的检出率高达14%。LAA是心房内血栓形成的最主要部位,其解剖结构、形态特点、收缩功能与附壁血栓的形成密切相关。LAA是一个形状不规则的狭长管状盲腔,其内存在较多的梳状肌及肌小梁,腔内流速减慢且血流易产生涡流,具有血栓形成的解剖结构特点。LAA一般有多个分叶,分叶数量与卒中事件的发生率有一定的相关性,一般分叶数量越多,血栓的发生风险也相应越高。LAA形态大致可分为4类:鸡翅膀形、仙人掌形、风向袋形和花椰菜形,LAA形态呈鸡翅膀形时血栓形成的概率相对较小。窦性心律时,LAA收缩功能正常,而在病理状态下,左房压力增高,左房及LAA均通过扩张来缓解左房压力,LAA入口随之增宽,容积增大,丧失了规律收缩的功能,排空速度减小,血流在LAA停留时间增加,血流淤滞易形成涡流,易促使血栓形成。新生附壁血栓容易脱落,从而导致各种栓塞事件的发生,明显增加了缺血性卒中的风险。AF患者LAA内血栓形成的几个可能的病理生理机制,主要包括:左心房壁异常、血流淤滞、凝血功能增强。AF患者的LAA开口处较非AF患者增大,进入LAA的血流速度减慢,心率增快,心律不齐,使LAA不能有效地收缩,血流淤滞,易于形成血栓。另一方面,AF快速的心室率对LAA的血流动力学存在一定的影响,AF患者LAA内的血流相对滞留时间较非AF患者增高,易形成血液淤滞,促进血栓形成。AF患者伴有的血小板活化水平升高,血栓前状态和纤维蛋白溶解异常,与心房内皮细胞受损、促血栓形成物的产生和高凝状态有关。CHADS2评分及CHA2DS2-VASc评分用来评估AF患者发生卒中的危险程度,CHADS2或CHA2DS2-VASc评分≥2的AF患者,除有禁忌症,需进行口服抗凝治疗(IA类推荐)。AF患者在启动抗凝治疗之前应常规评估出血风险,临床上多采用HAS-BLED评分进行评估。HAS-BLED积分≥3分时提示出血风险为高危,出血高危患者接受抗凝治疗应谨慎,并在开始治疗后定期复查,但是并不代表HAS-BLED积分增高是抗凝治疗禁忌证。对已合并心房血栓的AF患者,需常规启动抗凝治疗,并在进行AF复律或消融治疗前,应再次行TEE检查,明确是否仍有血栓形成。维生素K拮抗剂(vitamin K antagonists,VKA),通过抑制肝脏环氧化还原酶,以干扰维生素K依赖性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的活化,从而达到抗凝的目的。VKA,如华法林,对血栓栓塞并发症具有良好的预防作用。目前指南推荐合并心房血栓的AF患者使用华法林抗凝治疗3周后再次检测LAA是否仍形成血栓,国际标准化比值(international normalized ratio,INR)控制在2.0～3.0之间。但是华法林与多种食物、药物存在潜在的相互作用,起效和代谢缓慢,个体之间差异很大,药物浓度难以预测,治疗窗口狭窄,需要定期测量INR进行治疗监测,不断调整药物剂量,因此患者依从性相对较低。INR治疗范围内时间(time in therapeutic range of INR,TTR)用来评价华法林抗凝控制的效果。个体TTR是指每个患者在目标范围内的INRs数和INR测量总数的比值,平均TTR是临床中心所有服用华法林患者个体TTRs的平均值。根据2012年ESC的AF治疗指南,控制良好的华法林治疗应具有较高的平均TTR,建议最好≥70%。达比加群酯是一种新型口服抗凝药物,为直接凝血酶抑制剂,具有高特异性,药物起效快,药代动力学可预测,固定剂量,不需监测或剂量调整,与药物和食物的相互作用小。克服了华法林的不足。达比加群酯已作为华法林的替代治疗,用于临床预防非瓣膜病性AF卒中和全身性栓塞。现有临床证据支持使用达比加群酯治疗非瓣膜病性心房血栓,仅限于个案报道,尚缺乏达比加群酯和华法林的前瞻性对比研究。综上所述,达比加群酯和华法林可有效预防非瓣膜病性AF患者卒中和全身性血栓栓塞的发生,但对于非瓣膜病性AF合并心房内血栓的患者,两者的疗效缺乏前瞻性对比研究。因此,在综合分析国内外相关文献及临床治疗实际情况的基础上,我们提出针对非瓣膜病性AF合并心房内血栓的患者,达比加群酯150mgbid或华法林(INR控制在2～3之间)抗凝治疗3个月,可能会对心房内血栓产生一定治疗效果。研究目的1.研究达比加群酯150mg bid对非瓣膜病性AF心房内血栓的治疗效果;2.研究治疗非瓣膜病性AF心房内血栓,达比加群酯150mgbid能否有效替代华法林;3.探讨抗凝治疗非瓣膜病性AF心房内血栓的机制。研究方法1.入选标准TEE发现心房内血栓形成的非瓣膜病性AF患者。2.排除标准(1)对药物活性成分或药物辅料过敏;(2)严重肾功能不全(CrCL<30mL/min);(3)临床活动性出血;(4)具有大出血的主要危险因素,包括当前或近期的消化道溃疡、高出血风险的恶性肿瘤、近期的脑或脊髓损伤或手术、近期颅内出血、已知或疑似食管静脉曲张、动静脉畸形、血管瘤、主要椎管内或颅内血管异常;(5)与其他抗凝剂进行联合治疗;(6)严重的肝功能损害或肝脏疾病;(7)与全身性酮康唑、环孢霉素、伊曲康唑、他克莫司、德隆达隆联合治疗。3.TEE检查抗凝前及抗凝治疗3个月后,分别进行TEE检查。局部麻醉后,将5-MHz多平面经食道超声探头,从食管插入到心脏后方,通过主动脉瓣短轴及左室两腔心切面观察LAA形态结构,多平面探查LAA。右心耳通常在食管中段进行检查。在心房或心耳存在的致密的回声光团即为血栓形成。4.实验分组根据患者个人选择的抗凝药物,将患者分为两组:D组:患者口服达比加群酯150mg bid抗凝治疗3个月;W组:患者口服华法林(INR维持在2～3之间)抗凝治疗3个月。5.研究仪器Philips Ultrasound IE33彩色多普勒超声仪;Philips Ultrasound Transducer 5.0MHz多平面探头。6.治疗期间监测华法林初始给药从低剂量(如1.5mg/d-3.0mg/d),初始INR不达标时,按照1.0mg/d-1.5mg/d增加剂量,连续检测INR(3～5天/次),直到INR达标。当INR达标后,每7-10天检测一次,华法林剂量相对固定后,每两周检测1次。患者在接受华法林口服抗凝过程中,若发生其他疾病或者应用了其他可能会影响华法林作用的药物,应增加INR检测频率,并根据具体情况对华法林剂量做出相应的调整。7.随访患者在抗凝治疗1个月和3个月到门诊进行随访评估,定期进行电话随访,如有卒中、全身栓塞、严重出血症状时,立即联系就医。抗凝口服治疗3个月后再次行TEE检查。主要研究终点:卒中、全身性栓塞、血管性死亡、心肌梗死、全因死亡、住院治疗;安全终点:严重出血。主要观察指标:抗凝治疗前后血栓的变化(消退、缩小、不变、增大或形成新的血栓)。抗凝治疗期间注意观察:呕血,咯血,血尿,牙龈出血,刷牙出血,鼻出血,不明原因的皮下瘀斑瘀点,针刺处出血时间延长,大便带血,消化不良,恶心呕吐,腹痛腹泻,关节疼痛等。8.统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理。连续变量表示为平均数±标准差,采用t检验进行比较。分类变量以频率和百分比(%)表示,采用卡方检验和Fisher确切概率法进行比较。血栓的治疗效果,定义为血栓减少的面积与原面积的比值,采用秩和检验进行两组间的比较。p<0.05为差异具有统计学意义。研究结果1.初次TEE检出的心房内血栓特征TEE检出的血栓面积为0.1～4.48cm2,血栓形成的位置绝大部分位于LAA。W组血栓面积大于D组血栓面积(1.45±1.04cm2vs0.64±0.54cm2,p<0.05)。2.基线资料经TEE确诊的非瓣膜病性AF合并心房内血栓患者共41名,根据患者个人的选择,19位患者接受达比加群酯150 mg bid,其余22位患者接受剂量调整的华法林治疗。两组基本资料无明显统计学差异。3.监测与随访在治疗过程中,W组INR的监测次数平均为11次,平均TTR为72%,超出治疗范围的时间(INR>3)少于5%,华法林控制情况良好。D组有1例患者服用达比加群酯后,因胃肠道严重不适,停止抗凝2周。抗凝过程中,W组有1例患者出现缺血性卒中,两组均无严重出血发生。4.再次TEE血栓演变情况经过3个月抗凝治疗后,再次TEE检查显示,D组17例患者(17/19例,89.5%)和W组17例患者(17/22例,77.3%)均未检测到血栓形成,表明血栓已经完全溶解。其余患者再次TEE检查仍然发现血栓形成,其中D组1例和W组4例患者血栓面积较初始面积缩小,除此之外,两组各有1例患者血栓面积较3个月前增大。5.两组血栓治疗效果的比较血栓的治疗效果,定义为血栓减少的面积与原面积的比值,两组血栓的治疗效果没有统计学差异(p>0.05)。研究结论1.达比加群酯150mgbid对非瓣膜病性AF心房内血栓有明确的治疗效果,与华法林的效果没有差异;2.固定剂量的达比加群酯克服了华法林定期监测和剂量调整的不足,为非瓣膜病性AF合并心房内血栓的患者提供了更好的选择;3.非瓣膜病性AF合并心房内血栓抗凝治疗时,连续不间断服用达比加群酯尤其重要。