第一部分　　研究背景:炎症性肠病(IBD)是一种反复发作，迁延不愈的慢性肠道炎症性疾病，包括炎症限制在大肠的溃疡性结肠炎(UC)和炎症发生在胃肠道任何部位的克罗恩病(CD)。近几年，研究发现间充质干细胞(MSCs)在治疗IBD过程中有较好的治疗效果。但是在治疗过程中MSCs是如何发挥作用以及哪些信号通路及信号分子在治疗过程中起着重要作用，目前尚不清楚。　　目的:主要研究间充质干细胞在治疗修复炎症性肠病动物模型过程中Wnt/β-catenin信号通路以及相关信号分子的表达情况与作用。　　方法:　　1、实验分组：18只健康雄性 SD大鼠购自于广东省实验动物中心，将其随机分为3组，每组6只大鼠。3组分别是正常对照组、IBD组和MSCs治疗组。同时还设有一组单纯MSCs细胞组。　　2、实验性IBD模型大鼠的建立：用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)通过灌肠的方法进行制作IBD大鼠模型。　　3、MSCs细胞培养及细胞移植：标记有绿色荧光蛋白（GFP）的MSCs购买于美国Cyagen Biosciences Inc.公司。用L-DMEM培养基培养MSCs细胞并进行细胞传代。将生长良好的间充质干细胞调整细胞浓度为2×106/ml并通过尾静脉注射方法注入IBD大鼠模型体内，进行细胞移植治疗。　　4、全基因组表达谱芯片分析及差异基因筛选：通过对大鼠受损修复大肠组织的总RNA的提取，将其逆转录成cDNA，其中RNA和ds-cDNA的定量及质量保证通过NanoDrop ND-1000技术。再用Axon GenePix400B基因芯片扫描仪进行扫描，将扫描的数据信息导入NimbleScan v2.6软件，筛选P<0.05，FC>2为差异基因。根据差异基因结果分析及相关文献的查找，筛选出本实验主要研究的差异基因。　　5、荧光定量 PCR技术应用于筛选出差异基因的验证，分析发生炎症以及MSCs细胞移植治疗后第14天和第28天时的相关信号分子表达情况，并分析可能起到的作用。　　结果:　　1、成功建立实验性IBD模型大鼠：肉眼观察可见大鼠肠壁充血发炎，并有大范围的溃疡形成。　　2、MSCs细胞培养及细胞移植成功：MSCs细胞生长良好，并能稳定表达绿色荧光蛋白。通过尾静脉注射移植 MSCs细胞后，在显微镜下可观察到 MSCs分布于IBD大鼠模型肠道炎症部位。　　3、通过表达谱基因芯片结果分析，得到差异表达基因有388个，其中包括191个上调基因和197个下调基因。其中与增殖分化相关的Wnt信号通路与差异基因表达密切相关，再结合相关文献的查找，筛选出与 Wnt/β-catenin信号通路相关的Wnt3a，Fzd3，Wnt5a，Wnt11，GSK-3β,β-catenin，c-myc，cyclin D，TCF4和APC等信号分子作为本实验主要研究的对象。　　4、经典Wnt/β-catenin信号通路在炎症及修复过程中的表达情况：Wnt3a基因在IBD组中表达量(2.92±0.94)明显高于正常组，而在MSCs治疗组中表达量比其他两组均明显降低。GSK-3β基因在炎症过程中表达水平显著减少，而在MSCs移植组中的表达水平恢复到正常水平，与正常组没有明显差异。β-catenin基因在IBD组中的表达水平比正常组水平显著增高，MSCs移植治疗后表达水平与IBD组比较明显下降，但与正常组水平相比无明显差别。其他相关基因比如Fzd3、c-myc和TCF4等在炎症发生过程中没有明显变化，但在细胞移植治疗过程中表达量均显著降低。　　5、非经典 Wnt/β-catenin信号通路在炎症及修复过程中的表达情况：Wnt11基因在IBD组第14天时表达量较正常水平显著下降，在第28天表达量恢复到正常水平，与正常组比较无明显差异。当MSCs细胞移植后Wnt11基因表达水平较IBD组和正常组均显著降低。而 Wnt5a基因在 IBD组和正常组中没有明显变化，在MSCs移植后的第28天表达量较正常对照组和IBD组显著下降。　　结论:　　1、通过 TNBS灌肠诱导实验性炎症性肠病大鼠模型成功建立，可见大鼠大肠组织有溃疡、炎症现象发生。　　2、MSCs移植到IBD大鼠模型后可观察到MSCs能够定植于大鼠的炎症组织区域，并起到修复作用。　　3、在IBD炎症发生时，经典Wnt/β-catenin信号通路能够被Wnt3a激活，而在MSCs细胞移植修复过程中经典信号通路相关的信号分子表达水平下降，经典信号通路可能被抑制，从而促进MSCs分化成为肠上皮细胞，促进炎症的好转。　　4、非经典Wnt/β-catenin信号通路相关分子Wnt11的表达水平在炎症发生时表达下降，非经典信号通路可能被抑制，在MSCs移植修复过程中Wnt5a和Wnt11表达水平均显著下降，非经典信号通路可能同样被抑制。　　第二部分　　研究背景:红细胞在体外储存的过程会产生一系列“储存损伤”，比如红细胞形态变化、细胞膜的损伤以及生理生化等方面的变化。近期的研究发现一氧化氮（NO）含量水平的下降与红细胞储存损伤有关，添加NO能改善储存红细胞的变形性。而三磷酸腺苷（ATP）是红细胞的直接供能物质，同样与储存损伤密切相关。目前已经成为公认的最为重要的血液质量指标之一。　　目的:研究储存红细胞在体温环境下添加NO供体SNP后NO及ATP含量变化，以探索添加NO供体后对红细胞储存质量的影响。　　方法:　　1、红细胞储存过程中NO及ATP含量检测：采集5名健康O型献血者血液样本，制成悬浮红细胞，分成新鲜红细胞组和储存红细胞组。新鲜红细胞组在采集后1h内检测NO及ATP含量。储存红细胞组在储存20天时检测其NO及ATP含量。　　2、储存红细胞中添加不同浓度NO供体，确定本实验中适合的添加浓度：红细胞储存20天时添加终浓度为1、5、25μM硝普钠（SNP）进行37℃孵育30min，检测添加SNP后红细胞中NO及ATP含量水平的变化，根据结果数据分析确定适合的添加SNP浓度。　　3、添加适合的SNP后放入4℃冰箱中保存不同的时间段，探索添加SNP后保存过程中NO及ATP含量变化：确定适合的添加浓度后，添加SNP孵育30min后保存于4℃冰箱中在0h、1h、4h三个时间段检测NO及ATP含量的变化，探索添加SNP后对血液质量的影响以及可能作用的时间长度。　　结果:　　1、红细胞储存过程中NO及ATP含量水平明显下降：储存红细胞中总NO（7.63±2.62 vs.15.56±2.26,P<0.05）、胞浆NO（2.21±1.68 vs.5.81±1.79,P<0.05）、结合NO（5.42±2.00 vs.9.75±2.73,P<0.05）以及ATP含量水平（3.16±0.91 vs.8.10±1.21，P<0.05）均较新鲜组红细胞水平显著下降。　　2、添加不同浓度SNP后，NO及ATP含量检测结果：在储存红细胞中添加不同浓度1、5、25μM SNP后，通过对实验数据分析，发现添加1μM SNP的储存红细胞中NO及ATP含量未发生改变；添加5μM SNP的储存红细胞中总NO（14.15±1.76 vs.7.63±2.62,P<0.05）、胞浆NO（6.10±1.95 vs.2.21±1.68,P<0.05）、结合NO（8.05±1.44 vs.5.42±2.00,P<0.05）和ATP含量（6.16±1.29 vs.3.16±0.91，P<0.05）较添加前明显增加；添加25μM SNP的储存红细胞中NO含量显著增加，但过高的NO能够损伤红细胞变形性，同时 ATP含量没有明显变化。最终确定5μM SNP为本实验适合的添加浓度。　　3、添加SNP后不同时间段的检测结果：添加5μM SNP，37℃孵育30min后0h时总NO、胞浆NO、结合NO以及ATP含量明显增加，与新鲜组水平无明显差别。添加后保存1h检测NO含量与新鲜组无差别，ATP含量较新鲜组明显增加。添加后保存4h检测NO含量明显下降，下降至储存组水平；ATP含量恢复到新鲜组水平，但含量较储存组明显增加。　　结论:　　1、通过对新鲜组和储存组的实验数据比较发现20天储存红细胞中NO及ATP含量水平与新鲜组比较明显下降。　　2、向储存20天的红细胞添加不同浓度1、5、25μM的NO供体硝普钠（SNP），添加后在37℃孵育箱中孵育30min，发现添加5μM SNP能够明显增加储存红细胞中NO及ATP含量。　　3、添加5μM SNP的储存红细胞在37℃孵育30min后红细胞中NO含量在孵育后0h和1h的含量水平能够恢复到新鲜组水平，但在4h时下降到储存组含量水平。而红细胞中ATP含量在4h内均保持着较高的含量水平。在储存红细胞中添加5μM SNP有可能改善储存红细胞的血液质量。