论文部分内容阅读
目的:增殖抑制基因(HSG)又称为线粒体融合蛋白基因(mfn2)能够有效的抑制受损伤血管平滑肌增殖及细胞周期,使细胞停滞于G0/G1期,近来文献报道mfn2基因能抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡,本实验主要探讨HSG基因诱导肝癌细胞凋亡、抑制细胞增殖的机制,以及观察Bax/Bcl-2蛋白家族及其凋亡通路以及线粒体凋亡通路在mfn2诱导肝癌细胞凋亡中的作用。方法:构建含mfn2 cDNA片段的腺病毒Ad-mfn2以及质粒pEGFP-C2-mfn2和pCDNA3.1⊕-mfn2,体外感染或转染入肝癌细胞内,并以含有绿色荧光蛋白的腺病毒Ad-GFP以及空白质粒pEGFP-C2、pCDNA3.1⊕为阴性对照组,Western Blot检测HSG高表达组和对照组细胞内线粒体凋亡通路关键蛋白Bax. Bcl-2、p53、caspase-3、caspase-9、PARP、Apaf-1等的差异,流式细胞术检测肝癌细胞周期及凋亡的变化。分离并提纯肝癌细胞线粒体蛋白及胞浆蛋白,Western Blot观察细胞色素C和Bax在细胞内不同细胞器中含量的变化。构建短发卡RNA shR-mfn2和shR-bax并共转染入正常肝细胞L02和肝癌细胞,流式细胞术、DNA ladder和CCK-8检测细胞凋亡和增殖的变化,报告基因方法检测肝癌细胞高表达mfn2基因后caspase-3活性的变化。结果:感染Ad-mfn2的mfn2高表达组和转染pCDNA3.1⊕-mfn2的中表达组凋亡显著增加(p<0.01),较对照组细胞总蛋白内Bax、Bcl-2、p53表达无显著性差异,但Caspase-3、PARP.Apaf-1蛋白表达显著增加(p=0.004、p=0.045、p=0.010)。Ad-mfn2转染培养的HepG2后,细胞周期阻滞在G0/G1期,S期细胞数量显著减少,而凋亡显著增加。高表达HSG细胞线粒体蛋白内细胞色素C减少、Bax增加,相对细胞浆内细胞色素C增加、Bax减少,两者有显著性差异(细胞色素C:p=0.024 VSp=0.040;Bax:p=0.018 VSp=0.039).正常肝细胞shRNA干扰mfn2表达显著促进细胞增殖,其与干扰bax表达组无显著性差异(p=0.196)。高表达mfn2组肝癌细胞转染入shR-bax使细胞凋亡显著被抑制(p=0.0103)。肝癌细胞高表达mfn2基因后caspase-3活性相对于对照组及空白对照组显著增加(p<0.01)。结论:mfn2基因过表达可以抑制肝癌的生长,促进肝癌细胞的凋亡,mfn2是潜在重要的抑癌基因,其在肝癌细胞中的凋亡和抑制增殖作用与Bax/Bcl-2凋亡通路及线粒体凋亡通路有关。提示mfn2基因在认识及防治肝癌中较大前景。