【摘 要】
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研究背景近年来随着RNA生物学、化学、稳定性和递送系统的技术进步,m RNA领域正在蓬勃发展,其中稳定的输送系统能使m RNA疫苗在体内发挥最大潜能。脂质纳米颗粒（LNPs）是最常用的递送系统之一,一种极简的类脂聚合物C1被证明可以在抗原递呈细胞（APCs）内有效递送m RNA,并诱导出强烈的T细胞激活反应。乙肝病毒（HBV）引起的慢性乙型肝炎（CHB）是一种全球性健康问题,目前用干扰素与核苷/核
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研究背景近年来随着RNA生物学、化学、稳定性和递送系统的技术进步,m RNA领域正在蓬勃发展,其中稳定的输送系统能使m RNA疫苗在体内发挥最大潜能。脂质纳米颗粒（LNPs）是最常用的递送系统之一,一种极简的类脂聚合物C1被证明可以在抗原递呈细胞（APCs）内有效递送m RNA,并诱导出强烈的T细胞激活反应。乙肝病毒（HBV）引起的慢性乙型肝炎（CHB）是一种全球性健康问题,目前用干扰素与核苷/核苷酸（NUCs）药物治疗CHB都无法获得长期的病毒学控制,寻找和开发新的治疗方法仍然是一项巨大的挑战。已有多项研究证明以HBV抗原蛋白为基础的治疗性疫苗在体内外实验中取得了良好效果。我们的研究构建了一种类脂聚合物C1包裹体外转录的HBV LHBs m RNA形成的m RNA纳米疫苗,并想要探究这种疫苗的抗HBV治疗效果以及可能的作用机制。研究方法与材料1、构建HBV复制小鼠模型:将p AAV/HBV1.2质粒溶解在相当于10%小鼠体重的PBS溶液中,用高压水动力法（Hydrodynamic Injection,HDI）在5-8s内给C57BL/6小鼠尾静脉注射质粒,定期检测小鼠生化指标和病毒学指标。2、m RNA疫苗的制备:构建m RNA表达载体,对m RNA进行不同修饰提高稳定性。m RNA体外转录和纯化、合成m RNA疫苗。3、在HBV复制小鼠腹股沟皮下注射C1-LHBs m RNA疫苗后定期取血,用ELISA法检测血清中各生化指标评估心脏、肝脏和肾脏的功能,以及对心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏组织进行苏木精-伊红（H＆E）染色探究m RNA疫苗的生物安全性。4、用ELISA法检测血清HBV表面抗原（HBs Ag）、e抗原（HBe Ag）,用q PCR法检测HBV DNA水平,同时用免疫组织化学方法（IHC）检测肝组织HBc Ag阳性情况探究m RNA疫苗的治疗效果。5、用流式细胞术和ELISA法检测BMDCs表面共刺激分子和上清中细胞因子的表达情况,探究m RNA疫苗对BMDCs的免疫刺激作用。6、利用共聚焦显微镜观察类脂聚合物C1是否携带m RNA进入细胞。研究结果1、给HBV复制小鼠注射C1-LHBs m RNA疫苗后,各组小鼠血清生化指标无明显差异,各器官组织无明显损伤,表明m RNA疫苗在体内不具有明显生物毒性。2、给HBV复制小鼠注射C1-LHBs m RNA疫苗后,血清中HBs Ag、HBe Ag和HBV DNA水平明显下降,肝组织HBc Ag阳性率也明显下降,表明m RNA疫苗有显著的抗HBV治疗效果。3、用C1-LHBs m RNA疫苗体外刺激BMDCs后,细胞表面的共刺激分子表达上调,上清中细胞因子分泌增加,证明m RNA疫苗可以促进BMDCs成熟和诱导细胞因子分泌。4、共聚焦显微镜观察到类脂聚合物C1可以携带m RNA进入细胞。研究结论C1-LHBs m RNA疫苗具有显著的抗HBV效果并且在体内无明显生物毒性;C1-LHBs m RNA疫苗可以诱导BMDCs成熟和分泌炎性细胞因子。
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