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全蝎和蜈蚣已被用作中药数千年。全蝎和蜈蚣作为有毒中药,它们的毒液是独特的资源,其中包括丰富的具有高度靶向功能的蛋白质以及多肽类成分。全蝎、蜈蚣毒液的一些多肽提取物具有广泛的抗病毒作用,尤其是全蝎的5～10 KDa多肽片段与蜈蚣的5 KDa以下多肽片段活性最让人关注。本文研究了全蝎的蝎梢的多肽粗提物(peptide extract from scorpion tail,PEST)与蜈蚣的蜈蚣顶的多肽粗提物(peptide extract from centipede head,PECH)在HepAD38细胞中的抗乙肝病毒(Hepatitis B Virus,HBV)作用。主要研究内容和结果如下:1.超滤法制备全蝎与蜈蚣的多肽粗提物取蝎梢、蜈蚣顶于4℃匀浆后,使用超滤管进行超滤,全蝎取10 KDa以下5 KDa以上部分超滤液命名为PEST,蜈蚣取5 KDa以下超滤液命名为PECH,使用真空冷冻干燥机进行浓缩,浓缩液测得多肽浓度分别为6 mg/mL和5.5 mg/mL,重金属含量检测结果表明这两种提取物重金属含量均无超标。2.MTT方法测定PEST与PECH对肝癌细胞HepAD38与HepG2毒性在96孔板接种HepAD38细胞,使密度约为6×10~4个/孔,培养2天后,撤去四环素,分别加入PEST(0.125、0.25、0.5和1 mg/mL)、PECH(0.125、0.25、0.5和1 mg/mL),另设空白对照组只加细胞培养液,培养2天后,换上新的含药培养液与空白对照培养液,继续培养3天后再使用MTT法在酶标仪570 nm处测定吸光度。HepG2细胞接种密度约为1×10~4个/孔,孵育12 h后,分别加入PEST及PECH。在孵育相应时间后(24、48、72 h)使用MTT法测定吸光度。实验结果表明,PEST、PECH作用于HepAD38细胞和HepG2细胞时,细胞存活率均在70%以上,PEST和PECH对肝癌细胞HepAD38和HepG2均无明显毒性。3.PEST与PECH在HepAD38细胞中的抗乙肝病毒作用接种HepAD38细胞培养2天后,撤去四环素,设置PEST组,PECH组,0.25μmol/L拉米夫定(Lamivudine,LAM)组,0.01μmol/L恩替卡韦(Entecavir,ETV)组,含有6.86?mol/L四环素(Tetracycline,TEL)的四环素组以及只加空白细胞培养液的对照组,培养2天后,更换一次,继续培养3天。吸取上清,收获细胞。使用乙型肝炎病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒检测细胞上清的HBV DNA含量,ELISA试剂盒检测细胞上清的HBV表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)和HBV早期抗原(Hepatitis B early antigen,HBeAg)含量,经过细胞内总RNA提取和采用荧光定量PCR检测HBV X/S/preC/P基因表达量,蛋白印迹法检测HBV core蛋白的合成。实验结果表明,1 mg/mL PEST组和PECH组抑制HBV DNA效果最佳,1 mg/mL PEST组明显抑制HBsAg(P<0.05)、HBeAg(P<0.01)的分泌,1 mg/mL PECH组明显抑制HBsAg、HBeAg的分泌(P均<0.01),1 mg/mL PEST组和1 mg/mL PECH组分别下调HBV P基因mRNA相对表达量(P均<0.05);PEST对core蛋白合成几乎无影响,PECH能够抑制HBV Core蛋白合成,并且抑制效果接近于阳性对照药物LAM和ETV。综上所述,得到以下结论:PEST和PECH在HepAD38细胞株中表现出抑制HBV活性的作用。作用机制可能是PEST和PECH抑制HBV P基因相对表达量,PECH还抑制HBV core蛋白合成。