目的:人前脑啡肽原(hPPE)作为内源性阿片肽的一种,其镇痛作用明确,同时较外源性阿片类镇痛物质相比副作用小,无成瘾性,为镇痛研究提供了物质基础。本课题通过基因工程技术获得人前脑啡肽原基因序列,构建人前脑啡肽原基因重组载体pcDNA3.1(+)／hPPE,在转染试剂脂质体2000作用下实现重组载体在HEK293细胞中的表达,为后期的转移性骨肿瘤模型镇痛研究提供工具。　　 方法:提取人脑组织总RNA,在反转录酶作用下合成DNA互补链即cDNA,依据GeneBank中报道的前脑啡肽原基因序列设计上下游引物,以cDNA为模板PCR法合成hPPE基因序列后克隆于测序载体pMD-18T上,测序分析。hPPE基因序列测序分析正确后,限制性内切酶HindⅢ、NotⅠ双酶切pMD—18T／hPPE和真核表达载体pcDNA3.1(+),在T4DNA连接酶作用下连接hPPE基因和真核表达载体pcDNA3.1(+),酶切凝胶电泳鉴定重组载体pcDNA3.1(+)／hPPE后,转化大肠杆菌(JM109),扩增提取重组载体。在转染试剂脂质体2000作用下,重组载体pcDNA3.1(+)／hPPE转染HEK293细胞。于转染后48hRT—PCR检测人前脑啡肽原基因,72h后放射免疫法检测人前脑啡肽原表达。　　 结果:　　 1、RT—PCR法成功扩增出人前脑啡肽原基因序列,经凝胶电泳鉴定可扩增出800bp左右基因片段与文献中报道一致；经测序分析与GeneBank中报道的人前脑啡肽原基因序列比对,同源性达100％。　　 2、限制性内切酶HindⅢ、NotⅠ双酶切重组载体pcDNA3.1(+)／hPPE,凝胶电泳鉴定扩增出5400bp基因片段和800bp左右基因片段,与文献中报道的pcDNA3.1(+)、hPPE基因序列一致。　　 3、重组载体pcDNA3.1(+)／hPPE、真核表达载体pcDNA3.1(+)分别转染HEK293细胞,于转染48h后搜集pcDNA3.1(+)／hPPE转染组、阴性对照pcDNA3.1(+)转染组、HEK293细胞组这三组细胞。以B—action为内参,RT—PCR检测这三组细胞中hPPE基因:结果可见pcDNA3.1(+)／hPPE转染组扩增出800bp左右的hPPE基因片段,阴性对照pcDNA3.1(+)转染组、HEK293细胞组未扩增出基因片段。　　 4、重组载体pcDNA3.1(+)／hPPE、真核表达载体pcDNA3.1(+)分别转染HEK293细胞,于转染72h后搜集pcDNA3.1(+)／hPPE转染组、阴性对照pcDNA3.1(+)转染组、HEK293细胞组这三组细胞上清液。放射免疫法检测这三组细胞中人前脑啡肽原表达:结果可见阴性对照pcDNA3.1(+)转染组、HEK293细胞组未检测到人前脑啡肽原表达。pcDNA3.1(+)／hPPE转染组检测到人前脑啡肽原表达,其表达量可用pg级浓度表示。　　 结论:成功克隆出人前脑啡肽原基因,成功构建了人前脑啡肽原基因重组载体pcDNA3.1(+)／hPPE,并实现了人前脑啡肽原在HEK293细胞中的表达,为后期转移性骨肿瘤痛模型镇痛研究提供了有力的工具。