胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,大量患者死于术后转移和复发。胃癌的预后很差,但早期胃癌术后的五年生存率可高达95%以上。要提高胃癌的治愈率和五年生存率,重在早期发现和早期诊断。肿瘤发生的早期阶段,就有核酸释放入血,外周血循环肿瘤核酸中可检测到与肿瘤细胞一致的基因突变。外周血循环核酸包含循环DNA和循环RNA,循环DNA甲基化以及microRNA (miRNA)标志物已成为肿瘤标志物研究的热点,血清肿瘤标志物检测具有无创和易标准化等特点,为肿瘤的早期诊断和治疗提供了新的研究方向和领域。基因单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism, SNP)与胃癌的高发风险有显著的相关性,为胃癌高危人群的预警以及早期诊断提供了科学依据。因此对外周血中胃癌相关肿瘤标志物进行联合检测,是对胃癌实现早期诊断的有效措施,对改善胃癌预后也有着重要意义。随着纳米技术的飞速发展,磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles, MNPs)因其具有高比表面积和易分离等特点,已被广泛应用于各种生物分子的检测。本研究借助MNPs,通过对外周血进行循环核酸DNA异常甲基化和miR-21相对表达进行检测,并结合胃癌相关基因SNP研究,以便为胃癌的风险预测及早期诊断提供信息。在课题组研究基础上,最后还探索了一种基于Pd纳米颗粒的SNP分型技术。具体研究内容如下：1、基于磁分离的血浆循环DNA提取及甲基化检测应用MNPs可特异地将分离技术和富集技术有机地结合为一体,大大地提高了DNA提取效率,具有传统DNA提取方法无法比拟的优势。由于循环DNA在血浆中含量很少,提取质量直接影响到接下来的检测工作。因此我们选用合适的MNPs来提取血浆中循环DNA,并检测了胃癌相关E-cadherin基因启动子区甲基化,然后分析了患者临床病理特性与甲基化状态的关系。结果表明：胃癌患者中发生E-cadherin异常甲基化的比例高于正常对照,低分化与中低分化胃癌患者的异常甲基化比例显著高于中分化患者(P<0.05),溃疡型胃癌的异常甲基化检出率与非溃疡型存在显著差异(P<0.05)。因此,检测肿瘤患者外周血中循环DNA特异性改变可为肿瘤的早期诊断及病情监控提供新的手段,并有可能为肿瘤的治疗、术后监测及预后的判断提供重要依据。2、基于磁性纳米颗粒和化学发光技术的循环miR-21检测近几年来研究发现,某些miRNA具有类似于癌基因或抑癌基因的作用,miRNA几乎参与了胃癌发生与发展全过程,因此对于未来早期胃癌的筛查、诊断和治疗等方面,miRNA的应用有巨大潜力。研究表明,miR-21能促进细胞增殖诱发胃癌,为此,我们建立了MNPs和化学发光技术相结合的胃癌miR-21定量技术,检测了胃癌外周血标本中的miR-21相对表达量(miR-16作为内参进行校正),相对于正常对照组,miR-21在胃癌患者血清中的表达水平明显高于在正常个体血清中的表达水平,这种方法为胃癌的早期快速检测奠定了基础。3、基于磁分离和基因芯片技术的胃癌多态性研究本研究应用基于磁分离和双色荧光微阵列SNP分型方法,对118例苏北地区胃癌患者和120例正常对照进行了COX-2-765G>C和BCL-2-938C>A位点分型,探索其SNP位点与胃癌发病风险的关系,并进行多态性关联研究,具体分析COX-2基因-765G>C位点与BCL-2基因-938C>A位点在胃癌发病风险中的交互作用。结果表明,COX-2-765G>C位点在胃癌病例组中,59.3%为野生型,33.1%为杂合型和7.6%为突变型；在正常对照组中72.5%为野生型,23.3%为杂合型和4.2%为突变型。BCL-2基因-938C>A位点在胃癌病例组中,51.7%为野生型,44.1%为杂合型和4.2%为突变型；在正常对照组中分别为38.3%为野生型,51.7%为杂合型和10%为突变型。COX-2-765GC+CC基因型的个体在胃癌组中显著增高(OR=1.808,95%CI:1.050～3.113, P<0.05),-765C等位基因与苏北地区人群胃癌易感性增高相关(OR=1.701,95%CI:0.840～3.446,P<0.05)。BCL-2-938CC基因型的个体患胃癌的风险约是AA基因型个体的3倍,-938C等位基因在胃癌患者中检出率明显高于正常对照(73.7% vs 64.2%,P<0.05),是胃癌发病的风险因素。深入研究表明：COX-2-765CC/GC分别与BCL-2-938CC基因型在胃癌的发病风险中存在着明显的加乘交互效应,与COX-2-765GG和BCL-2-938AA基因型携带者相比,其胃癌的发病风险分别增高10倍和5倍(OR=10,95%CI:1.280～78.117, P＜0.05; OR=4.667,95%CI:1.137～19.154, P<0.05),统计学差异显著,说明COX-2基因和BCL-2基因在胃癌的发生中有明显的协同作用。4、基于Pd纳米颗粒的SNP分型方法初探Pd纳米颗粒作为一种重要的贵金属,具有良好的催化活性,但是至今为止,以Pd纳米颗粒为标记物检测DNA的相关报道很少,Pd纳米颗粒标记物相对于其它标记方法有很多优势：相对于Au等材料,Pd的价格低,能降低检测成本；相对于荧光分子标记物,Pd纳米颗粒更稳定,便于在光照条件下操作；相对于磁性纳米颗粒标记物,Pd纳米颗粒标记物催化Co或Ni后,不但可以检测磁性信号,应用于定量检测,而且可以放大检测信号,降低检测限,提高检测的灵敏度。为此,我们探索了一种基于Pd纳米颗粒的SNP分型方法,首先基于原位合成法制备了MUA@Pd纳米颗粒,成功连接上DNA进行DNA标记；然后用“三明治”杂交体系进行SNP分型,最后用“Pd标Ag染”的方法催化放大检测DNA信号。我们应用此方法对胃癌标本进行COX-2启动子区-765G>C多态位点的分型,临床样本分型的所有结果均与直接测序结果一致。