论文部分内容阅读
目的：研究血红素氧化酶1(HO-1)在对抗心肌缺氧-复氧损伤中的作用，并探讨环氧化酶2(COX-2)是否参与其作用机制。
方法：取雄性SD大鼠心脏，除去血液，转移、固定于Langendorff灌流装置，以改良K-H液行常规恒压灌流(76mmHg)。采用左心室内水囊传递压力测定心室内压，通过MedLab生物信号采集处理系统记录左室收缩曲线，并计算左室舒张末压(LVEDP)、左室发展压(LVDP)、最大左室收缩速率(+dP/dtmax)和最大左室舒张速率(-dP/dtmax)。在冠脉左前降支靠近分支处穿线结扎和松开制造离体心脏缺氧-复氧(anoxia-reoxygenation，A-R)模型，在灌流结束后，用1％伊文斯蓝使非缺氧区染成兰色，心脏冰冻后做切片，观察红色的非梗死区和灰白色的梗死区。将切片扫描后，用ImageJ图像分析软件计算梗死面积。在相应时点记录冠脉流量，同时收集冠脉流出液，用全自动生化分析仪分析其中乳酸脱氢酶(LDH)的释放量。取SD大鼠，分别腹腔注射生理盐水、高铁血红素或锌原卟啉Ⅸ，应用双波长分光光度计法间接测定大鼠血中CO含量。SD大鼠随机分为5组(每组n=8)。A组(A-R)：SD大鼠在实验前腹腔注射生理盐水，24h后取离体心脏灌流，稳定15min后，行缺氧-复氧(30min缺氧，2h复氧)。B组(Hemin+A-R)：SD大鼠在实验前腹腔注射HO-1的诱导剂高铁血红素50mg/kg，24h后取离体心脏，行缺氧-复氧。C组(ZnPP+A-R)：SD大鼠在实验前腹腔注射HO-1的抑制剂锌原卟啉Ⅸ50μg/kg，24h后取离体心脏，行缺氧-复氧。D组(MB+Hemin+A-R)：在hemin腹腔注射前1h，预先给予GC的抑制剂亚甲蓝(5mg/kg，ip)，其余和B组相同。E组(CEL+Hemin+A-R)：SD大鼠先腹腔注射COX-2的抑制剂塞来昔布3mg/kg，1h后给予腹腔注射hemin，其余和B组相同。2SD大鼠在实验前分别腹腔注射生理盐水、高铁血红素50mg/kg、或亚甲蓝5mg/kg+高铁血红素50mg/kg，24h后取血液和左心室，测定样本中cGMP的含量。SD大鼠在实验前分别腹腔注射生理盐水、高铁血红素50mg/kg、或塞来昔布3mg/kg+高铁血红素50mg/kg，24h后取心脏，测定样本中PGI2的稳定产物6-keto-PGF1α的含量。
结果：SD大鼠腹腔注射高铁血红素后24h，大鼠血中COHb的含量明显高于腹腔注射生理盐水组(P＜0.01)，而锌原卟啉Ⅸ腹腔注射后，大鼠血中COHb的含量明显下降(P＜0.01)。心脏单纯缺氧30min后，观察复氧期心脏的收缩功能发现，LVEDP明显增高，LVDP、±dP/dtmax则下降。实验前24h给予HO-1的诱导剂高铁血红素后，缺氧后的复氧期间，LVEDP增高的现象被明显抑制(P＜0.01)；而对于LVDP、±dP/dtmax的影响，不仅表现在可改善复氧期这些指标的下降，而且对缺氧期间LVDP、±dP/dtmax的下降亦有明显的对抗作用(P＜0.01)。高铁血红素对缺氧-复氧心脏的冠脉流量没有明显影响。但测定发现，心脏缺氧-复氧后5min时，LDH显著增高，而高铁血红素可部分抑制复氧期LDH的增高(P＜0.01)。同时，高铁血红素可明显缩小缺氧-复氧心脏的梗死面积(P＜0.01)。HO-1抑制剂锌原卟啉Ⅸ缺氧和复氧期间LVEDP并无明显影响；但在复氧120min时，LVDP和±dP/dtmax下降，与单纯缺氧-复氧组相比存在明显差异(P＜0.05)。锌原卟啉Ⅸ对缺氧-复氧心脏早期的冠脉流量减少现象有加重作用(P＜0.05)。而心脏缺氧-复氧后5min时，LDH明显高于单纯A-R组(P＜0.05)，同时，锌原卟啉Ⅸ可明显增加缺氧-复氧心脏的梗死面积(P＜0.01)。GC的抑制剂亚甲蓝使用后，可部分取消高铁血红素降低缺氧-复氧心脏LVEDP，增加LVDP、±dP/dtmax的作用(P＜0.05)，LDH的释放和梗死面积明显增加(P＜0.01)。COX-2的抑制剂塞来昔布可部分取消高铁血红素的降低LVEDP的作用(P＜0.01)，同时可对抗复氧期高铁血红素抑制LVDP和±dP/dtmax下降的作用(P＜0.05)，但对于缺氧期高铁血红素增加LVDP和±dP/dtmax的作用无明显影响。高铁血红素可抑制复氧期LDH的增高，而塞来昔布可部分取消高铁血红素的作用(P＜0.01)，心脏的梗死面积明显增加(P＜0.01)。高铁血红素腹腔注射24h后，血浆和心肌组织中cGMP水平增加，与生理盐水注射组相比P＜0.01。而在高铁血红素腹腔注射前给予亚甲蓝，血浆和心肌组织中cGMP含量下降(P＜0.01)。为了观察高铁血红素对心肌COX-2活性的影响，我们测定了心肌COX-2的主要代谢产物PGI2的含量(以其稳定产物6-keto-PGF1α的含量表示)。发现高铁血红素可增加心肌组织6-keto-PGF1α含量，而塞来昔布可取消此作用。
结论：本研究用高铁血红素诱导HO-1产生增加，24h后测定大鼠血中的CO浓度，发现其含量明显增加。同时高铁血红素可对抗心肌缺氧-复氧性损伤，且其作用不仅表现在复氧期的收缩功能改善，而且对缺氧期的心肌亦有明显的对抗损伤作用。同时，我们用HO-1的抑制剂锌原卟啉Ⅸ腹腔注射后，使大鼠血中CO的浓度降低，发现心肌缺氧-复氧性损伤作用明显加重了，提示内源性HO-1是心肌对抗缺血损伤所必需的，其表达增加可保护心脏免受缺血性损伤。
本实验结果表明，高铁血红素可增加血浆和心肌组织cGMP水平，而预先给予GC的抑制剂亚甲蓝后，高铁血红素对抗心肌缺氧保护作用被抑制。提示，HO/CO确实可通过鸟苷酸环化酶途径保护心脏免受缺氧性损伤。
本实验中还发现，用COX-2的抑制剂可阻断高铁血红素的保护作用，而高铁血红素确实可增加心肌COX-2的活性。因此推测，高铁血红素可通过HO-1途径，增加CO，调节COX-2活性，从而对缺氧心肌起到保护作用。但研究中我们也发现，高铁血红素对缺氧期心肌的保护作用并不能为COX-2的抑制剂所阻断，提示高铁血红素的心肌保护作用可能是通过多种机制，影响细胞内的多条信号通路来完成的。