海蓬子(Salicornia bigeloii Torr.)耐盐相关基因的差异表达及序列分析

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土壤盐分是农业系统中的一个重要问题,其严重性每年还在增加。土壤中的Na+会对大多数作物的生长和产量造成不利影响。而绝大多数的作物属于甜土植物,即使在中等盐分土壤条件下也会造成严重的产量下降。盐生植物对高盐分条件具有天然的抗性。海蓬子(Salicornia bigeloii Torr.)为典型的盐生植物,其最适生长环境需要高达100-400mmol/L NaCl的盐浓度水平。本实验首先通过构建其不同盐浓度下的抑制消减杂交cDNA文库并通过阳性克隆筛选和测序获得其部分差异表达序列标签(ExpressionSequence Tag,EST);将这些序列进一步在Genbank中进行了BLASTx/n的相似序列比对并将单一contig的序列通过Northern Blotting进行了表达水平差异的分析鉴定,对部分关键基因的表达差异在耐盐上的功能进行了分析。在此基础上通过3-RACE技术从该植物中克隆了细胞质膜水通道蛋白基因(SbPIP1),并对其表达、结构和进化树进行了研究。另外,在本实验获得的EST基础上结合数据库中的序列及碱蓬的EST序列,探讨了这两种盐生植物EST-SSR的分布情况,并对部分存在SSR的序列设计了PCR引物,进而在9种主要盐生植物之间进行了扩增分析,为进一步了解盐生植物的耐盐性提供了帮助。主要研究内容包括:   ⑴为提高缩叶肉质盐生植物海蓬子总RNA和mRNA的质量,将改良的CTAB法与Tripure试剂盒方法相结合,从300 mg发芽后20d的海蓬子幼苗中成功分离和纯化了高纯度的总RNA和tuRNA。并以无NaCl处理为Driver,以200 mmol/L,NaCl处理24h、48h和172h的幼苗为Tester,通过cDNA双链的合成及两次消减杂交和抑制PCR扩增,富集到两组处理中差异表达的大小在200~1200 bp的cDNA序列,pGEM-T的连接和蓝白斑筛选表明文库滴度和重组率分别达到2.6×106 pfu/mL和96%,共收集阳性克隆12000个,形成了抑制消减杂交的质粒cDNA文库。   ⑵从文库中随机挑取500个克隆进行单向测序,得到有效的差异表达序列标签363条;经重叠群分析(Contig analysis)共获得202条非冗余片段重叠群。经网上拼接和BLASTx/n比较,没有任何同源信息的有6条,得到单一接收号的EST(有同源信息的序列)有141条。141条ESTs中未知蛋白或假定蛋白占20条,而功能已知蛋白中(121条ESTs),E值>1E-05的“非显著同源序列”有23条,以上49条EST对于进一步研究海蓬子的耐盐新基因或新蛋白及明确其独特的耐盐机理有着重要的意义;E<1E-05的“显著同源序列”有98条。对“显著同源序列”进行功能分析表明与蛋白质代谢相关的最多,有23条(23.5%),其次是与能量和抗性相关的蛋白,分别有21条(21.4%)和14条(14.3%);从物种来源分析,有29条来自模式植物拟南芥,来自水稻和烟草的分别有17条和9条,来自其它盐生植物的也有5条;而来自动物和原核生物的共有8条,这表明海蓬子在200mmol/L NaCl胁迫的初期(<72h)与对照相比差异表达的基因种类和数目繁多。   ⑶从盐生植物海蓬子的抑制消减杂交文库中克隆了DnaJ-like基因的长609bp的cDNA序列,编码一个202 aa的开放阅读框,Northem Blotting显示该基因在检测子(200 mmol/LNaCl)中表达显著增强。生物信息学分析表明,在蛋白质水平上该片段与拟南芥和水稻的同源性分别为6E-68和1E-58;在核酸水平上该片段与拟南芥的同源性为3E-24。保守区分析表明该片段含有DnaJ-like基因完整的J功能域(J-Domain,66 aa),功能域在蛋白质水平与GenBank两种相关类型的J功能域的同源性分别为1E-11和9E-15。   ⑷利用抑制消减杂交结合3RACE技术首次从该盐生植物中克隆到一种细胞质膜水通道蛋白基因,命名为SbPIP1(GenBank接受号为DQ451602),该克隆的核苷酸和氨基酸序列长度分别为1242 bp和285 aa,氨基酸序列中含有MIP基因家族保守区及“-NPA-NPA-”水通道蛋白标签。反向Northern杂交显示其在200 mmol/L NaCl处理24-72 h时比无NaCl处理表达显著增强。将氨基酸序列与40种植物的细胞质膜水通道蛋白进行进化树分析表明其与甜菜PIP3(AAB67870)和波菜PIP1;2(AAR23268)的进化关系最为接近。SbPIP1具有较长的NH2-端(51 aa)和较短的C-端(8 aa)。与已知蛋白的高解析度结构相比表明,与细菌(E. Coli APQZ)和哺乳动物(Human AQP1,Bovine AQP1)的水通道蛋白序列相似性差异较大,虽然在形成水通道蛋白出入通道及选择性滤膜的关键氨基酸上一致性较高,但部分关键氨基酸酸的变化及位置效应可能会造成功能上的差异。这些都暗示了SbPIP1在分类和水分转运机制上不同于已报道的其它蛋白,虽然它们的序列相似性非常高。   ⑸利用本实验所得到的363条海蓬子ESTs和从数据库下载的1000条碱蓬ESTS进行了两种盐生植物的EST-SSR的发掘和分析。为了降低EST重叠所导致的SSR冗余,首先用DNAStar软件将所有EST形成147和470条无重复的一致序列,从这些EST中总共发现了30种64个SSR重复,其中有7种类型在两种盐生植物中共同存在。海蓬子的EST-SSR的平均分布为7.8kb,而碱蓬为5.0kb。CT重复的出现频率最高,占碱蓬48个SSR的18.8%。从碱基重复的个数来看,三碱基的数量最多,占总数的47.9%,而二碱基重复、四碱基重复和五碱基重复分别占总数的22.9%、12.5%和8.3%。大多数含SSR的EST都可以初步推断其SSR所处的位置是在编码区(CDS)、5’非翻译区(5’UTR)还是3’非翻译区(3’UTR)。BLASTn/x分析表明高达52.6%的翻译氨基酸在数据库中没有同源序列。通过设计引物并进一步在9种盐生植物中的扩增表明,有5对引物可以在两种盐生植物之间扩增出目标片段,但在其它植物上却不能,包括另外一个藜科植物三角叶滨藜。
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