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目的：外胚间充质干细胞(Ecto-mesenchymal stem cells, EMSCs)是间充质干细胞的特殊类型,起源于胚胎时期的神经嵴(Neural crest),具有自我更新和多向分化潜能。本研究旨在探讨大鼠鼻黏膜来源的EMSCs的干细胞特性和多向分化潜能,并探讨其在纤维蛋白(Fibrin)支架上的多向分化潜能,为组织工程干细胞／支架移植寻找新的种子细胞。最后,将EMSCs/Fibrin支架移植到大鼠脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)模型,评价其对脊髓损伤的修复效果。方法:1.制作大鼠鼻黏膜冰冻切片,用EMSCs标志蛋白Nestin, CD133, CD44进行免疫荧光染色,观察其在大鼠鼻黏膜的分布特征。2.用差速贴壁法纯化EMSCs,并用成球实验及各种干细胞标志蛋白评价其干细胞特性。3.用成骨诱导培养基诱导EMSCs向成骨细胞分化。用碱性磷酸酶染色检测碱性磷酸酶活性；茜素红染色检测诱导后细胞表面钙结节来评价成骨诱导效果；用免疫荧光和蛋白免疫印迹检测Collagen-Ⅰ、Osteocalcin、Osteopuntin及Runx2的表达水平评价EMSCs向成骨细胞诱导分化的效果。4.用神经诱导培养基诱导EMSCs向神经细胞分化。用神经标志蛋白Synapsin, Synaptotagmin, GAP43及NF-200进行免疫荧光和蛋白免疫印迹,评价EMSCs向神经细胞的分化效果。5.用雪旺细胞诱导培养基诱导EMSCs向雪旺细胞分化。用雪旺细胞标志蛋白GFAP, p75, S100β, CNPase进行免疫荧光和蛋白免疫印迹,评价EMSCs向雪旺细胞的分化效果。6.EMSCs与大鼠脊髓来源神经干细胞进行Transwell非接触共培养,免疫荧光检测评价该体系下EMSCs对神经干细胞向神经细胞分化的影响。7.EMSCs与大鼠脊髓来源神经干细胞接触共培养,活细胞动态摄影及免疫荧光检测评价该体系下EMSCs对神经干细胞向神经细胞分化的影响。8.接触共培养体系中加入RGD, Integrinβ1抗体及BOC抗体,观察并简要探讨RGD, Integrinβ1抗体及BOC抗体对神经干细胞分化的抑制作用。9.用扫描电子显微镜检测(Scanning electron microscopy, SEM)及透射电子显微镜检测(Transmission electron microscopy, TEM)观察Fibrin支架的结构特征。EMSCs种植于Fibrin支架后,用苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin, HE)染色评价EMSCs与Fibrin支架的生物相容性。10.用免疫荧光和蛋白免疫印迹检测EMSCs在Fibrin支架上的自发分化情况。11用免疫荧光、蛋白免疫印迹、SEM和TEM等方法检测EMSCs在Fibrin支架上向成骨细胞、神经细胞和雪旺细胞的诱导分化效果(方法同上述3-5)。12.将EMSCs/Fibrin支架移植入大鼠脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)模型,观察EMSCs在脊髓的迁移情况,BBB评分(Basso-, Beattie, Bresnahan scoring)评价大鼠后肢运动功能恢复情况。用免疫荧光、免疫组化、TEM及蛋白免疫印迹等方法观察评价损伤脊髓神经元的再生情况。结果：1.鼻黏膜组织冰冻切片免疫荧光染色显示,CD 133, Nestin及CD44阳性细胞广泛分布于鼻中隔两侧黏膜固有层内。2.EMSCs在抗贴壁培养时,可形成CD 133, Nestin及Soxl阳性的干细胞球。差速贴壁纯化后的第三代EMSCs显示出很强的干性,表达神经外胚层干细胞相关蛋白和间充质干细胞标志蛋白Nestin, Soxl, Sox10, S100, Snail, Vimentin, CD44, CD133, Sall4及含RGD序列细胞外基质的受体integrinβ1等。3.EMSCs经成骨诱导培养基诱导2周后,碱性磷酸酶活性明显增强,成骨细胞标志蛋白Collagen-Ⅰ、Osteocalcin、Osteopuntin及Runx2的表达量明显升高。诱导3周后,茜素红染色可观察到大量的钙结节。4. EMSCs用神经诱导培养基诱导培养14天后,神经标志蛋白Synapsin, Synaptotagmin, GAP43及NF-200的表达量明显升高。5. EMSCs用雪旺细胞诱导培养基诱导培养14天后,雪旺细胞标志蛋白GFAP, p75, S100β, CNPase的表达量明显升高。6. EMSCs与脊髓来源的神经干细胞的Transwell非接触共培养结果显示,共培养组神经突触的数量和长度明显增加,并可形成神经网络。7.EMSCs与脊髓来源的神经干细胞接触共培养结果显示,单神经细胞组细胞表达神经细胞标志蛋白GAP43及神经胶质细胞标志蛋白GFAP,而共培养组只表达GAP43,不表达GFAP。8.接触共培养体系中加入RGD, Integrinβ1抗体及BOC抗体后,神经纤维的生长受到抑制。9.SEM和TEM检测不同浓度Fibrin支架的结构发现低浓度(12.5-50mg/ml)的Fibrin支架呈疏松多孔的海绵状结构,并且随着浓度升高,孔径减小,密度增加。而当纤维蛋白浓度达到75 mg/ml,纤维蛋白胶则聚集成块状结构。HE染色结果显示,EMSCs在低浓度Fibrin支架上生长良好。10.免疫荧光和蛋白免疫印迹结果显示,EMSCs在Fibrin支架上培养12天后,可表达雪旺细胞标志蛋白CNPase, MBP, GalCer及雪旺细胞可分泌的神经营养因子BDNF, NGF, NT-3等。11.免疫荧光、蛋白免疫印迹、SEM和TEM等结果显示,EMSCs在Fibrin支架上也可诱导分化为成骨细胞、神经细胞及雪旺细胞,并且分化效果优于在L-多聚赖氨酸(poly-L-Lysine, PLL)对照组,而且EMSCs能够改建Fibrin支架,使其更利于细胞的生长。12.将EMSCs/Fibrin支架移植入大鼠脊髓损伤模型,可观察到EMSCs从移植处向脊髓两端迁移。术后12周BBB评分结果发现大鼠后肢运动功能恢复情况良好,而对照组无明显恢复。免疫荧光、免疫组化、TEM及蛋白免疫印迹等结果显示,EMSCs/Fibrin移植组神经再生相关蛋白GAP43, NF-200及MBP的表达量明显高于SCI组及Fibrin组,神经再生能力明显提高,神经细胞被很厚的髓鞘包被。结论：1. EMSCs广泛分布于嗅部和呼吸部黏膜固有层内,并具有很强的干性,具有向成骨细胞、神经细胞及雪旺细胞分化的潜能。2.EMSCS与Fibrin支架生物相容性良好,并能在Fibrin支架上自发分化为雪旺细胞。3.EMSCs在Fibrin支架上能更有效的分化为成骨细胞、神经细胞和雪旺细胞,并可以改建Fibrin支架,使之更利于EMSCs的生长分化。4.EMSCs/Fibrin支架移植到大鼠横断脊髓损伤模型,能有效恢复大鼠后肢运动功能。EMSCs是组织工程中一种很有利用前景的种子细胞,可用于自体移植修复脊髓损伤。