肝癌的发生发展过程中会伴随抑癌基因或原癌基因的突变。含有这些突变的DNA片段会被释放到血液中,成为循环无细胞DNA (circulating-cell free DNA, cfDNA)。对cfDNA所携带信息进行检测可以间接获知非手术肝癌患者体内肿瘤细胞的遗传变化。抑癌基因p53的突变与多种癌症的预后相关。肝癌中p53的第249位密码子AGG→AGT突变(导致p53 R249S突变)是中国和撒哈拉以南非洲肝癌患者p53的高频突变。本文设计并比较了PCR产物直接测序,高分辨率融解曲线分析(HRM),特异性封阻PCR (ASB-realtime PCR)三种方法检测患者血液中是否包含该突变。我们发现特异性封阻PCR有较好的灵敏度和特异性(灵敏度至少为每个反应10拷贝,突变检测的特异性底限可达0.1%)。对569例来自于江苏启东地区肝癌患者(421例非手术患者,148例手术患者)进行检测后,发现290例含有p53 R249S突变(51.0%)。含有该突变的患者的总体生存时间与R249野生型患者相比,显著缩短(HR=1.933,95%置信区间为1.591-2.349,P<0.0001)。R249野生型p53的患者的中位生存时间为27.0个月(95%CI:18.6-35.4), p53 R249S突变的患者为7.0(95%CI：5.6-8.4)个月,(P<0.00001)。非手术患者中含有p53 R249S突变的中位生存时间为6.0个月,R249野生型的患者为16.0个月。手术患者中,含有p53 R249S突变的中位生存时间为21.0个月,R249野生型的患者为61.0个月。另外,单位血浆中总p53基因片段多的患者预后较差,但是含有p53 R249S突变基因的患者中,突变片段含量同预后关系不明显。这些结果证明ASB-realtime PCR是一种检测cfDNA中突变的好方法,p53 R249S是肝癌预后的一个重要指标。自噬是真核生物中一种保守的通过溶酶体对细胞内物质进行降解的过程。Atg8和其同源蛋白已经被证实在自噬过程中发挥重要作用。目前已知的人Atg8家族成员包括6种蛋白,分别为MAP1LC3A, MAP1LC3B, MAP1LC3C(本文中分别简写为LC3A, LC3B, LC3C), GABARAP, GABARAPL1和GABARAPL2。这些蛋白的哪些氨基酸或结构域对于他们同其他蛋白发生互作,发挥生理功能是关键的,还不是很清楚。分析人Atg8家族蛋白的变异剪接本可以为解决这些问题提供思路。我们选择LC3B作为重点研究对象,发现LC3B通过NAGNAG变异剪接可以产生一个缺少Arg68的变异剪接体,我们命名为LC3B-b。这种新型的LC3B分子不能进入正常的翻译后修饰方式,也不能定位到自噬体上。在之前的同源结构模拟结果提示Arg68的缺失可能会影响LC3B-b分子在溶液中的构象。因此,我们推测Arg68对于维持蛋白质正常生理构象有重要作用。通过温度梯度的圆二色谱检测和胰蛋白酶攻击实验表明,LC3B-b同正常剪接产生的LC3B-a相比,它对温度更敏感,暴露的胰蛋白酶酶切位点更多,提示LC3B-b分子内作用力减弱,结构疏松,这与同源结构模拟结果相符。这种构象异常严重抑制半胱氨酸蛋白酶Atg4B对LC3B-b分子C末端的剪切,导致LC3B-b的类泛素化修饰和自噬体定位受阻。另一方面,我们将Arg68突变成Ala后,LC3B未被切割的pro型分子显著增加,自噬体定位减少,细胞自噬水平降低。类似的现象在其他成员中同样存在。更进一步的结构分析显示,LC3B的Arg68同Atg4B的Aspl71能形成盐桥键,是两者互作的关键位点。Pull-down实验证明,突变LC3B的Arg68会减弱两者相互作用。体外酶切实验证实突变LC3B的Arg68或者ATG4B的Asp171均会降低ATG4B的酶切效率。综上,人Atg8家族蛋白的Arg68对于维持蛋白正常的溶液构象,促进蛋白相互作用有重要意义,是该家族蛋白发挥正常生理学功能的关键氨基酸。为了进一步探讨LC3B-b分子是否是可以被机体调控的具有生理学意义的功能分子,我们用荧光定量PCR特异性的检测了LC3B-a与LC3B-b分子的mRNA表达情况。发现在人的不同组织和不同的癌细胞系中LC3B-b分子占总LC3B分子的比例存在差异。而且LC3B-b的表达比例在Hep3B细胞受到饥饿刺激或缺氧刺激时会发生变化。这种变化虽然比较微弱,但提示我们LC3B的NAGNAG变异剪接可能受到机体调控。我们选取了两个含有与LC3B类似NAGNAG变异剪接基序的两个基因ABCE1和RBM8A,用同样的方法检测其变异剪接比例,发现在饥饿或缺氧刺激条件下,他们的剪接比例变化模式与LC3B不同,提示机体对NAGNAG变异剪接的调控可能存在基因特异性。机体对NAGNAG调控的生理学意义还有待于进一步研究。