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蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.exMurray)Trev.)又名千层塔,为石杉科多年生草本植物,其药用成分石杉碱甲是一种乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂,对预防和治疗老年性痴呆具有显著作用。目前,蛇足石杉资源被过度采摘,人工栽培发展滞后,导致市场需求无法得到满足。本研究通过蛇足石杉内生真菌多样性分析,发现蛇足石杉具有丰富的内生真菌,采用组织分离法分离出大量内生真菌,结合形态学和分子生物学对内生真菌进行鉴定,通过HPLC、ESI-MS检测筛选出产石杉碱甲菌株,同时由于内生真菌具有生物防治作用,通过平板拮抗、产挥发性物质和发酵液防病筛选试验筛选出防治灰霉菌菌株和防治核盘菌菌株,为获取高效产石杉碱甲的内生真菌,石杉碱甲工业化生产奠定了基础,同时为灰霉菌和核盘菌的生物防治剂提供了菌种资源。具体研究结果如下:1.利用Illumina MiSeq高通量测序技术对ITS扩增序测序,并通过OTU及物种群落分析、Alpha Diversity分析、Beta Diversity分析等方法对蛇足石杉内生真菌进行了相关多样性分析,从蛇足石杉体内检测到1800株内生真菌,其在根、茎、叶中的分布数目分别为824株、1045株、1167株;其中根、茎、叶内均有分布的有295株,单独存在于根、茎、叶内的数目分别为311株、240株和308株。蛇足石杉根、茎、叶中内生真菌的丰富度为:叶>茎>根,且不同器官内内生真菌群落结构差异显著,其内生真菌的多样性为筛选高效产石杉碱甲内生真菌研究提供了丰富信息和资源。2.通过PERMANOVA分析发现11个属(Derxomyces,Lophiostoma,Cyphellophora,Devriesia,Serendipita,Kurtzmanomyces,Mycosphaerella,Conoideocrella,Brevicellicium,Piskurozyma,Trichomerium)的内生真菌与蛇足石杉体内Hup A的含量呈现正相关性(最高相关指数CI=0.92),推测此11属的内生真菌具有替代蛇足石杉产Hup A的潜力。同时,物种间相关性分析结果表明,多种内生真菌与此11种属内生真菌之间存在正相关性,这些内生真菌对产石杉碱甲真菌具有的有益作用为挖掘高效产石杉碱甲的内生真菌提供了信息。3.从蛇足石杉中分离、纯培养得到180个内生真菌,通过形态观察和ITS序列分析,鉴定了50株内生真菌;通过HPLC、ESI-MS检测筛选出产石杉碱甲菌株Colletotrichum boninense HS7-1,为获取高效产石杉碱甲的内生真菌,石杉碱甲工业化奠定基础。4.利用平板拮抗检测发现7株蛇足石杉内生真菌能够抑制灰霉菌的生长,并且结合产挥发性物质和发酵液防病筛选试验发现Alternaria alternate HR38-7可以稳定的抑制灰霉菌,为获取抑制灰霉菌的生物防治剂提供了菌种资源。5.利用平板拮抗检测发现9株蛇足石杉内生真菌能够抑制核盘菌的生长,并且结合产挥发性物质和发酵液防病筛选试验发现Colletotrichum boninense HL33-6-1的抑制效果最优,Colletotrichum gloeosporioides HL33-12-3、Alternaria alternate HR38-7抑制效果次之,为获取抑制核盘菌的生物防治剂提供了菌种资源。