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机体pH值的稳定对于细胞正常功能的维持至关重要。在生理环境下，细胞通过H+的多种转运途径保持细胞外和细胞内的pH值稳定在7.3--7.0左右。在一些病理条件如炎症、缺血和肿瘤发生过程中，由于组织无氧糖酵解产生乳酸和ATP水解的H+积聚，导致体液pH值急剧下降。研究表明低pH值是类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)关节部位发生炎症反应的主要特征之一，在严重的RA疾病中，pH值甚至降低至5.5。近期研究表明胞外pH值的改变对关节软骨细胞功能和代谢有着重要的影响，RA的关节软骨损伤与关节局部组织的pH值降低密切相关。然而，对于局部组织酸化是通过何种途径影响关节软骨细胞并导致软骨损伤的机制目前仍有待进一步研究。酸敏感离子通道（acid-sesing ion channels, ASICs）是一类由胞外酸化后被激活的阳离子通道，开放的通道对Na+、Ca2+具有通透性，进而引起细胞一系列生理病理变化。目前为止，已克隆了由4个基因编码的7个ASICs亚基： ASIC1a、ASIClb、ASIClb2、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3、ASIC4。ASICs广泛分布于哺乳动物的外周神经系统和中枢神经系统。越来越多的研究证实ASICs在组织酸化（如慢性炎症和脑缺血）等病理生理过程中发挥重要作用。其中Ca2+通透性ASIC1a在缺血性脑损伤过程中发挥的作用引起了人们的强烈关注。而RA病程中由于炎症导致关节局部组织酸化与缺血性脑损伤导致的酸中毒具有相似的病理特征,因此，本课题组建立与人类RA发病机制和病理特点极为相似的大鼠佐剂性关节炎（Adjuvant Arthritis，AA）模型，以观察ASICs在RA病程中的作用并探讨其可能机制。本课题组前期研究结果首先证实了SD大鼠关节软骨中存在ASIC1a、ASIC2a和ASIC3mRNA及其蛋白的表达，并且在AA大鼠关节软骨中ASIC1a、ASIC2a和ASIC3的表达均明显高于正常组；进一步研究发现非甾体类抗炎药阿司匹林对AA大鼠关节软骨的保护作用与抑制ASICs表达有关；体内研究证实，ASICs非特异性阻滞剂Amiloride对AA大鼠关节软骨具有保护作用，这种保护作用机制与抑制AA大鼠关节软骨胞外基质（Extracellular matrix，ECM）的II型胶原（type II collagen, COII）和蛋白多糖（aggrecan,Acan）丢失有关。正常生理状况下，软骨细胞通过合成II型胶原和蛋白多糖等基质以及维持MMPs与TIMPs间平衡保持关节软骨的完整功能。AA大鼠关节软骨损伤与软骨细胞对软骨基质的合成减少及MMPs（matrix metalloproteinas,MMPs)与TIMPs（tissueinhibitor of metall-oproteinas, TIMPs）之间的代谢平衡破坏有关。研究表明胞外酸化通过影响软骨细胞ECM、MMPs、TIMPs的代谢平衡从而导致关节软骨损伤。那么，这种损伤是否与软骨细胞中的酸感受器ASICs有关呢？阻断ASICs对AA大鼠关节软骨的保护作用是否通过影响软骨细胞ECM、MMPs、TIMPs的代谢平衡来实现的呢？其作用机制又是什么?为此，我们进行了下列三部分研究：1ASIC1a对大鼠关节软骨细胞Ca2+浓度的影响本研究中，分别采用RT-PCR、荧光染色法和Western blot法检测大鼠关节软骨细胞ASIC1a mRNA和蛋白的表达，并进一步检测ASIC1a对大鼠关节软骨细胞内Ca2+浓度的影响。研究结果显示，大鼠关节软骨细胞存在ASIC1a mRNA和蛋白的高表达；胞外酸化刺激可显著增加大鼠关节软骨细胞内Ca2+的浓度，ASIC1a特异性阻滞剂PcTx-1可显著减少大鼠关节软骨细胞内Ca2+的浓度，并可减轻由于钙离子超载导致的大鼠关节软骨细胞培养上清中LDH活性增高。但在无钙离子培养基中，胞外酸化刺激对大鼠关节软骨细胞内Ca2+浓度无明显的影响。以上研究结果提示，阻断ASIC1a可抑制大鼠关节软骨细胞内钙离子浓度，并且通过抑制大鼠关节软骨细胞内Ca2+浓度超载保护关节软骨细胞。2ASIC1a对大鼠关节软骨细胞基质代谢的影响本研究中，主要观察ASIC1a对大鼠关节软骨细胞基质代谢的影响。首先，通过脂质体2000转染试剂将ASIC1a siRNA序列瞬时转染到大鼠关节软骨细胞中，建立大鼠关节软骨细胞ASIC1a表达沉默模型，并使用对二甲基亚甲蓝分光法检测大鼠关节软骨细胞培养上清中GAG的含量，氯胺T法检测培养上清中HYP的含量，ELISA法检测MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的含量。结果显示，本研究中设计并合成的ASIC1a siRNA序列可成功建立ASIC1a表达沉默模型，胞外酸化刺激可通过激活ASIC1a调控大鼠关节软骨细胞对GAG、HYP、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的代谢。进一步分析发现，ASIC1a对MMP-2、MMP-9代谢的调控水平远远低于对GAG、HYP、TIMP-1和TIMP-2代谢的调控。ASIC1a表达沉默可阻断胞外酸化激活ASIC1a导致的GAG、HYP、TIMP-1和TIMP-2代谢水平下降，而对MMP-2和MMP-9的影响相对较小。以上研究结果提示，阻断ASIC1a可通过不同程度调控大鼠关节软骨细胞GAG、HYP、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的代谢水平导致ECM合成增加、降解减少，从而保护AA大鼠关节软骨。3MAPK信号通路在ASIC1a调控大鼠关节软骨细胞基质代谢中机制的研究本文前期研究结果显示ASIC1a调控大鼠关节软骨细胞的基质代谢，但其具体的分子机制仍不清楚。本部分试验主要研究MAPK信号通路在ASIC1a调控大鼠关节软骨细胞基质代谢中的机制。研究结果显示，ASIC1a激活可介导大鼠关节软骨细胞磷酸化p38MAPK和磷酸化ERK1/2蛋白表达，并激活核转录因子c-jun和c-fos蛋白的表达；钙离子螯合剂BAPTA-AM可抑制磷酸化p38MAPK和磷酸化ERK1/2蛋白表达，并抑制核转录因子c-jun和c-fos的表达；p38MAPK抑制剂可抑制核转录因子c-jun蛋白表达，ERK1/2阻滞剂可抑制核转录因子c-fos蛋白表达；MAPK信号通路可调控大鼠关节软骨细胞GAG、HYP、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的mRNA和蛋白表达水平。本部分试验结果提示胞外酸化激活ASIC1a通过激活Ca2+依赖的ERK/c-fos信号通路调控GAG、HYP、TIMP-1和TIMP-2的代谢和Ca2+依赖的p38MAPK/c-jun信号通路调控MMP-2和MMP-9的代谢，阻断ASIC1a通过抑制Ca2+依赖性ERK/c-fos和p38MAPK/c-Jun信号通路调控大鼠关节软骨细胞基质代谢，进而抑制AA大鼠关节软骨的损伤,保护AA大鼠关节软骨。