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目的1.以育龄期妇女输卵管和输卵管妊娠组织标本为研究对象,探讨酪氨酸激酶受体EphA2 (erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2, EphA2)、EphA2磷酸化蛋白(Phospho-EphA2, Pho-EphA2)在输卵管和输卵管妊娠组织中的表达与变化,分析EphA2和Pho-EphA2表达变化与输卵管妊娠的关系。2.观察整合素β1在人输卵管组织中的表达规律,上皮性钙粘蛋白(E-cadherin, E-cad)、整合素β1、局部粘着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)磷酸化蛋白(Phospho-FAK, Pho-FAK)在输卵管妊娠种植部位、非种植部位和分泌期壶腹部组织的表达与变化。分析EphA2与E-cad、整合素β1、Pho-FAK在输卵管妊娠发生中可能存在的相互关系。3.体外培养人输卵管上皮细胞,检测EphA2激活后,FAK的磷酸化情况以及输卵管上皮细胞粘附性的改变,分析在输卵管上皮细胞中,EphA2通路激活与FAK活化及输卵管上皮细胞粘附性改变的关系,推测EphA2在输卵管妊娠中的作用机制。材料与方法1. EphA2及Pho-EphA2在输卵管和输卵管妊娠组织中的表达29例人输卵管组织石蜡标本,包括峡部、壶腹部和伞部,按子宫内膜组织学分期法分为增生早期组(n=8)、增生中晚期组(n=6)、分泌早期组(n=7)和分泌中晚期组(n=8),17例输卵管妊娠组织石蜡标本分为种植部位组(n=17)和非种植部位组(n=17)。14例未破裂型输卵管壶腹部妊娠新鲜标本,均包括种植和非种植部位的组织,分为种植部位组(n=14)和非种植部位组(n=14)。12例人分泌期输卵管壶腹部组织新鲜标本作为对照组(n=12),取自因子宫肌瘤、子宫腺肌症等行全子宫加附件切除术的患者。应用免疫组化法和激光共聚焦显微镜法(laser cofocal scaning microscopy, LCSM)检测输卵管和输卵管妊娠石蜡标本中EphA2的表达,应用荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测输卵管妊娠组织中的EphA2 mRNA水平,应用免疫印迹法(Western blotting)检测输卵管妊娠组织中EphA2和Pho-EphA2蛋白表达与变化。2.E-cad在输卵管妊娠组织中的表达输卵管壶腹部妊娠新鲜标本取材和分组同“材料和方法”第一节中所述,应用免疫组织化学法观察E-cad蛋白在输卵管妊娠组织中的表达,应用qRT-PCR和Western blotting检测种植部位组、非种植部位组和分泌期壶腹部对照组组织中的E-cad mRNA和蛋白表达与变化。分析在输卵管妊娠种植部位组织中EphA2、Pho-EphA2与E-cad蛋白表达的相关性。3.整合素β1、Pho-FAK在输卵管及输卵管妊娠组织中的表达取材和分组同“材料与方法”第一节中所述,应用免疫组化和荧光显微镜观察输卵管粘膜上皮中整合素β1的表达,应用Western blotting检测输卵管妊娠种植部位、非种植部位及分泌期壶腹部组织中整合素β1、Pho-FAK蛋白表达与变化。分析EphA2、Pho-EphA2与整合素p1、Pho-FAK蛋白表达的相关性。4. EphrinAl-Fc对输卵管上皮细胞的影响采集12例外观正常输卵管新鲜标本,应用刮取法分离、溶血法和差速贴壁法纯化输卵管上皮细胞,予重组蛋白EphrinA1-Fc刺激输卵管上皮细胞后,应用Western blotting检测其Pho-EphA2、Pho-FAK的表达水平,应用噻唑兰(3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium, MTT)比色法检测发生粘附的输卵管上皮细胞数。5.统计学分析实验数据以x±s表示,免疫组化数据以阳性单位PU值表示,qRT-PCR数据以定量PCR仪收集CT值进行计算分析,Western blotting数据以目的条带与内参GAPDH条带灰度值比值表示目的蛋白的相对量。应用单因素方差分析、Pearson相关性分析、Spearman等级相关分析,采用SPSS 14.0统计软件包,双侧a=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。结果1. EphA2及其磷酸化蛋白在人输卵管和输卵管妊娠组织中的表达在月经周期的各个时期,在输卵管峡部、壶腹部、伞部粘膜上皮中纤毛细胞和分泌细胞的胞浆和胞膜均可见EphA2的表达,间质细胞未见阳性表达。在月经周期的同一时期,EphA2在输卵管峡部、壶腹部、伞部粘膜上皮各部表达水平无显著性差异(P>0.05)；输卵管峡部、壶腹部、伞部粘膜上皮中EphA2表达水平在在各自月经周期中表达无显著性差异(P>0.05)。应用qRT-PCR检测,EphA2 mRNA在种植部位组、非种植部位组与分泌期壶腹部组表达水平之间比较无显著性差异(P>0.05)。EphA2蛋白在输卵管妊娠种植部位组中表达水平显著高于非种植部位组和分泌期壶腹部对照组(P<0.05),非种植部位组与分泌期壶腹部组表达水平比较无显著性差异(P>0.05)。Pho-EphA2在种植部位组的表达水平显著低于非种植部位组和分泌期壶腹部组(P<0.05),非种植部位组与分泌期壶腹部组表达水平比较无显著性差异(P>0.05)。2.E-cad在输卵管和输卵管妊娠组织中的表达E-cad在分泌期壶腹部上皮细胞的表达情况与输卵管妊娠非种植部位上皮细胞表达情况相似,均表达于人输卵管粘膜上皮细胞的胞膜。E-cad mRNA和蛋白表达水平在种植部位组显著低于非种植部位组和分泌期壶腹部组(P<0.05),非种植部位组与分泌期壶腹部组的比较无显著性差异(P>0.05)。在输卵管妊娠种植部位,E-cad蛋白与EphA2蛋白表达水平呈负相关(r=-0.758,P<0.05),与Pho-EphA2表达水平不具有相关性(P>0.05)。3.整合素p1、Pho-FAK在输卵管和输卵管妊娠组织中的表达在月经周期的各个时期,输卵管峡部、壶腹部、伞部粘膜上皮纤毛细胞和分泌细胞的胞浆均见整合素β1表达,其中纤毛细胞的纤毛也有表达。输卵管峡部及壶腹部粘膜的整合素β1表达水平,在月经周期组之间比较无显著性差异(P>0.05)；在输卵管伞部,分泌早期组的表达水平显著高于增生早期、增生中晚期及分泌中晚期组(P<0.05)；在月经周期同一时期,输卵管峡部、壶腹部及伞部之间整合素β1表达水平的比较无显著性差异(P>0.05)。输卵管妊娠种植部位的滋养层细胞和蜕膜细胞,以及非种植部位粘膜上皮的纤毛细胞和分泌细胞的胞浆中均见整合素β1表达,在输卵管妊娠粘膜,种植部位组的整合素β1表达水平显著高于非种植部位组(P<0.05),显著高于分泌期壶腹部组(P<0.01),非种植部位组的表达水平显著高于分泌期壶腹部组(P<0.05)。Pho-FAK在种植部位表达水平显著高于非种植部位和分泌期壶腹部(P<0.05),非种植部位与分泌期壶腹部无显著性差异(P>0.05)。在输卵管妊娠种植部位组织中,整合素β1和Pho-FAK蛋白表达水平分别与EphA2表达呈正相关(r=0.705和0.740,P<0.05),与EphA2磷酸化蛋白呈负相关(r=-0.447和-0.395,P<0.05)。4. EphrinAl-Fc对体外培养输卵管上皮细胞的影响建立人输卵管上皮细胞体外培养模型,收集新鲜输卵管标本(n=12),培养输卵管上皮细胞,原代至第4代输卵管上皮细胞纯度为90.7%±3.1%。应用重组蛋白EphrinAl-Fc刺激体外培养的人输卵管上皮细胞,检测到Pho-EphA2的表达水平升高,到10min时达到峰值,到120min时Pho-EphA2表达水平下降到空白对照组的表达水平。Pho-FAK表达水平下降,到10min时,其表达水平降至最低值,而后表达水平升高。在刺激2min到60min,EphrinA1-Fc组Pho-EphA2表达强度显著高于IgG-Fc组,在刺激10min到60min,EphrinA1-Fc组Pho-FAK表达水平显著低于IgG-Fc组(P<0.05),到120min两组之间不存在显著性差异(P>0.05)。应用Spearman等级相关分析,Pho-EphA2的表达水平与Pho-FAK存在负相关(r=-0.848,P<0.05)。应用MTT比色法检测发生粘附的输卵管上皮细胞数,从EphrinA1-Fc刺激30min开始,EphrinA1-Fc组细胞粘附数显著低于空白对照和IgG-Fc对照组(P<0.05)。结论1.EphA2在人输卵管不同部位、不同月经周期组中的表达水平稳定,提示其在正常输卵管上皮细胞中的表达水平可能不受性激素调控,存在特殊的调控机制,这种机制在某些病理情况下,促使EphA2的表达水平表现出显著性改变。EphA2 mRNA在输卵管妊娠组织和对照组中表达水平无差异,但EphA2蛋白在种植部位表达水平显著升高,Pho-EphA2在种植部位表达水平显著降低,表明EphA2在蛋白转录水平并无增强,其蛋白水平表达增加,是由于自身降解减少引起,提示EphA2蛋白和磷酸化蛋白表达变化可能参与胚胎在输卵管粘膜的种植。2. E-cad mRNA和蛋白在输卵管妊娠种植部位表达水平低于非种植部位和分泌期壶腹部,提示E-cad在输卵管妊娠种植部位表达水平降低,有利于滋养细胞在种植部位的浸润。E-cad蛋白表达降低与EphA2蛋白表达升高呈负相关,推测E-cad在输卵管妊娠种植部位表达水平的降低,可能与EphA2表达变化存在联系。3.在输卵管伞部,整合素β1在分泌早期组的表达水平显著高于增生早期、增生中晚期及分泌中晚期组。而峡部和壶腹部在各自月经周期中比较均无显著性差异。整合素p1和Pho-FAK在输卵管妊娠种植部位中表达水平均高于非种植部位及分泌期壶腹部,提示整合素β1表达和FAK的磷酸化参与胚胎在输卵管粘膜的异常种植。在输卵管妊娠种植部位,整合素p1和FAK磷酸化蛋白表达,分别与EphA2磷酸化蛋白水平呈负相关,与EphA2表达水平呈正相关。推测在输卵管妊娠发生过程中,EphA2表达异常伴有整合素β1和FAK磷酸化蛋白表达的上调,促进了输卵管上皮细胞粘附性升高。4.人工重组蛋白EphrinA1-Fc刺激体外培养的输卵管上皮细胞,可以引起EphA2的磷酸化水平升高,降低FAK的磷酸化水平,并可抑制整合素介导的输卵管上皮细胞粘附。推测在病理条件下,EphA2的失活可能减弱这种抑制作用,引起输卵管上皮细胞粘附性升高,导致胚胎与输卵管上皮的异常粘附,促使输卵管妊娠发生。