论文部分内容阅读
香蕉穿孔线虫[Radopholus similis(Cobb,1893) Thorne,1949]是一种毁灭性的迁移内寄生植物病原线虫，广泛分布于热带、亚热带地区，严重危害粮食作物、果树和蔬菜等重要经济作物以及观赏植物等，是造成世界香蕉产量损失的主要原因之一。然而该线虫的防治仍然是一个世界性的难题，施用杀线剂是目前普遍采用和比较有效的防治方法，但杀线剂等化学药剂的大量使用对环境和人类造成极大的危害和其它负面影响，在许多国家和地区已被严格限制使用。因此研究和建立香蕉穿孔线虫防治的新途径和新方法已迫在眉睫，生物防治因其具有绿色环保、经济安全和可持续性等特点而受到重视和越来越多研究。
胞外蛋白酶已被证实是食线虫微生物侵染线虫的重要毒力因子。本研究构建了香蕉穿孔线虫发生地香蕉根际土壤的微生物宏基因组 Fosmid 文库，从中筛选获得一个杀线虫活性较强的蛋白酶基因（编号 pase4），另外，从来自不同寄主的香蕉穿孔线虫 10 个种群中筛选得到一株优势可培养伴生细菌——荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）pf36 菌株；在此基础上，通过载体转化和三亲本转导的方法将杀线虫蛋白酶基因pase4导入到pf36细胞中并使其正确表达，以期利用pf36与香蕉穿孔线虫的伴生关系，使杀线虫蛋白酶基因pase4通过pf36介导实现对香蕉穿孔线虫生长发育或侵染致病的抑制作用，从而达到有效防治香蕉穿孔线虫的目的；最后对遗传改造菌株的生物学特征、产蛋白酶活性、遗传稳定性、土壤定殖能力、体外杀线虫活性、盆栽生防效果及其对香蕉作物安全性进行了测定和评估。主要获得以下结果：
1.对香蕉根际土壤细菌、古菌16S rDNA和真菌18S rDNA进行高通量测序和种类多样性分析，其丰富度和多样性由高至低依次为细菌＞真菌＞古菌，优势类群分别为酸杆菌GP1（Acidobacteria GP1）、Penidiella和Fervidicoccus，各类群中均存在一定比例的未能分类（unclassified）的序列。
2.构建了香蕉根际土壤微生物宏基因组Fosmid文库，文库包含约35000个克隆，平均插入片段大小为30 kb左右，覆盖微生物基因组大小约1.05Gb，通过功能驱动筛选方法获得6个具有蛋白酶水解活性的克隆子Pro1~Pro6；分别构建Pro1~Pro6的亚克隆筛选得到3个具有蛋白酶活性的亚克隆子Pro1’、Por4’和Pro6’，3个亚克隆子的发酵上清液均具有不同程度的杀线虫活性，其中Pro4’处理杀线虫活性最大。
3.对亚克隆子Pro1’、Pro4’和Pro6’的插入序列分析表明各自包含一个完整的开放阅读框，分别编码3个相对应的蛋白酶（PASE1、PASE4和PASE6）；3种蛋白酶均为分泌型亲水蛋白。
4.通过原核表达获得成熟的蛋白酶PASE4，大小约为32 kDa，并证实PASE4能有效降解香蕉穿孔线虫的体内组织，具有显著的杀线虫活性；建立了利用胡萝卜纯愈伤组织培养繁殖无菌香蕉穿孔线虫的方法。
5.从来自不同寄主植物的香蕉穿孔线虫10个种群中共分离得到53株可培养伴生细菌，确定洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）和短小芽孢杆菌（Bacillus cereus）为供试线虫种群的优势伴生细菌；并以荧光假单胞菌pf36菌株作为遗传改造的目标菌株。
6.通过载体转化和接合转导的方法将杀线虫蛋白酶基因pase4导入伴生细菌pf36获得了遗传改造菌p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36；p4MCS-pf36的产蛋白酶能力和杀线虫活性均比p4Tn5-pf36高，但后者遗传稳定性、土壤定殖能力和盆栽防治效果均好于前者。
7.确定了p4Tn5-pf36产蛋白酶的优化发酵体系：培养组分为甘油10 mL/L、酵母粉15 g/L、氯化钾1 g/L，培养条件为温度34.5℃、初始pH7.66、接种量为8.0%、转速274r/min；优化后发酵液中最高蛋白酶活力为109.928 U/mL，比优化前提高1.58倍。
综上所述，本研究从构建的香蕉根际土壤微生物宏基因组中筛选获得一个具有较强杀线虫活性的蛋白酶基因 pase4，并从不同的香蕉穿孔线虫种群中分离得到一株优势伴生细菌荧光假单胞菌pf36菌株；通过分子生物学方法成功将基因pase4导入到菌株 pf36 中并正确表达，并获得了遗传稳定良好且对香蕉穿孔线虫具一定防效改造菌株。初步实现了以伴生细菌为载体介导表达生防因子抑制香蕉穿孔线虫生长繁殖或侵染致病的的目的。研究结果将为香蕉穿孔线虫的防治提供安全、有效的新方法，同时也为研究建立高效、环保和可持续的植物线虫生物防治技术提供新策略和新途径。
胞外蛋白酶已被证实是食线虫微生物侵染线虫的重要毒力因子。本研究构建了香蕉穿孔线虫发生地香蕉根际土壤的微生物宏基因组 Fosmid 文库，从中筛选获得一个杀线虫活性较强的蛋白酶基因（编号 pase4），另外，从来自不同寄主的香蕉穿孔线虫 10 个种群中筛选得到一株优势可培养伴生细菌——荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）pf36 菌株；在此基础上，通过载体转化和三亲本转导的方法将杀线虫蛋白酶基因pase4导入到pf36细胞中并使其正确表达，以期利用pf36与香蕉穿孔线虫的伴生关系，使杀线虫蛋白酶基因pase4通过pf36介导实现对香蕉穿孔线虫生长发育或侵染致病的抑制作用，从而达到有效防治香蕉穿孔线虫的目的；最后对遗传改造菌株的生物学特征、产蛋白酶活性、遗传稳定性、土壤定殖能力、体外杀线虫活性、盆栽生防效果及其对香蕉作物安全性进行了测定和评估。主要获得以下结果：
1.对香蕉根际土壤细菌、古菌16S rDNA和真菌18S rDNA进行高通量测序和种类多样性分析，其丰富度和多样性由高至低依次为细菌＞真菌＞古菌，优势类群分别为酸杆菌GP1（Acidobacteria GP1）、Penidiella和Fervidicoccus，各类群中均存在一定比例的未能分类（unclassified）的序列。
2.构建了香蕉根际土壤微生物宏基因组Fosmid文库，文库包含约35000个克隆，平均插入片段大小为30 kb左右，覆盖微生物基因组大小约1.05Gb，通过功能驱动筛选方法获得6个具有蛋白酶水解活性的克隆子Pro1~Pro6；分别构建Pro1~Pro6的亚克隆筛选得到3个具有蛋白酶活性的亚克隆子Pro1’、Por4’和Pro6’，3个亚克隆子的发酵上清液均具有不同程度的杀线虫活性，其中Pro4’处理杀线虫活性最大。
3.对亚克隆子Pro1’、Pro4’和Pro6’的插入序列分析表明各自包含一个完整的开放阅读框，分别编码3个相对应的蛋白酶（PASE1、PASE4和PASE6）；3种蛋白酶均为分泌型亲水蛋白。
4.通过原核表达获得成熟的蛋白酶PASE4，大小约为32 kDa，并证实PASE4能有效降解香蕉穿孔线虫的体内组织，具有显著的杀线虫活性；建立了利用胡萝卜纯愈伤组织培养繁殖无菌香蕉穿孔线虫的方法。
5.从来自不同寄主植物的香蕉穿孔线虫10个种群中共分离得到53株可培养伴生细菌，确定洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）和短小芽孢杆菌（Bacillus cereus）为供试线虫种群的优势伴生细菌；并以荧光假单胞菌pf36菌株作为遗传改造的目标菌株。
6.通过载体转化和接合转导的方法将杀线虫蛋白酶基因pase4导入伴生细菌pf36获得了遗传改造菌p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36；p4MCS-pf36的产蛋白酶能力和杀线虫活性均比p4Tn5-pf36高，但后者遗传稳定性、土壤定殖能力和盆栽防治效果均好于前者。
7.确定了p4Tn5-pf36产蛋白酶的优化发酵体系：培养组分为甘油10 mL/L、酵母粉15 g/L、氯化钾1 g/L，培养条件为温度34.5℃、初始pH7.66、接种量为8.0%、转速274r/min；优化后发酵液中最高蛋白酶活力为109.928 U/mL，比优化前提高1.58倍。
综上所述，本研究从构建的香蕉根际土壤微生物宏基因组中筛选获得一个具有较强杀线虫活性的蛋白酶基因 pase4，并从不同的香蕉穿孔线虫种群中分离得到一株优势伴生细菌荧光假单胞菌pf36菌株；通过分子生物学方法成功将基因pase4导入到菌株 pf36 中并正确表达，并获得了遗传稳定良好且对香蕉穿孔线虫具一定防效改造菌株。初步实现了以伴生细菌为载体介导表达生防因子抑制香蕉穿孔线虫生长繁殖或侵染致病的的目的。研究结果将为香蕉穿孔线虫的防治提供安全、有效的新方法，同时也为研究建立高效、环保和可持续的植物线虫生物防治技术提供新策略和新途径。