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第一部分DAPK1在结直肠癌肿瘤干细胞及上皮间质转化中的作用目的:明确DAPK1在结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)及上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用。方法:利用Oncomine数据库分析DAPK1在CRC肿瘤组织中的表达量,并使用免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)方法在33例CRC病人的肿瘤组织和癌旁组织中检测DAPK1的表达水平变化,分析其与CRC病人临床病理特征的相关性。利用Western blot和PCR检测DAPK1及干细胞标志物CD133在CRC组织中蛋白及m RNA水平的相关性,检测DAPK1在不同细胞系中的表达水平。用EMT诱导剂TGF-β1处理结肠癌细胞系SW480和DLD1,Western blot检测DAPK1的表达变化。利用慢病毒载体在SW480和DLD1中建立DAPK1敲除细胞系,用球培养的方法检测CRC细胞成球能力的变化,CCK8检测两种细胞系对不同化疗药物包括氟尿嘧啶、顺铂和阿霉素的耐受性,流式细胞术检测细胞凋亡,同时行Western blot和PCR检测干细胞标志物CD133、性别决定相关基因簇2(SOX-2)和CD44的表达水平变化,以明确DAPK1敲除对CSCs干性的影响。行Transwell迁移实验和划痕实验检测DAPK1敲除对CRC细胞迁移能力的影响,免疫荧光检测细胞间紧密连接的变化,Western blot和PCR检测EMT标志物E-cadherin、Zo-1和N-cadherin的表达变化,并行免疫荧光验证E-cadherin和N-cadherin在细胞膜上的表达。裸鼠皮下成瘤实验明确DAPK1敲除对CRC细胞系成瘤性的影响,并在皮下肿瘤中利用IHC检测CD133表达,利用免疫荧光检测E-cadherin、Zo-1表达,以在体内实验中明确DAPK1失活在CSCs和EMT中的作用。结果:纳入Oncomine数据库中4个独立实验的7个分析结果的荟萃分析结果显示DAPK1在CRC中表达明显降低(中位秩:1840.0,P=1.37E-4)。IHC结果显示DAPK1在CRC组织中表达降低(66.7%vs.39.4%,P=0.48),且与淋巴结转移和肿瘤分化相关。Western blot和PCR结果显示DAPK1在CRC组织中表达降低伴随着CD133表达升高。在细胞系中,DAPK1在正常结肠上皮细胞NCM460中的表达量高于除DLD1外的大部分结肠癌细胞系,此外,DAPK1在转移灶细胞系SW620中表达量低于其在同病人原发灶细胞系SW480中的表达。经TGF-β1诱导后,CRC细胞系中DAPK1表达量降低。DAPK1敲除后,SW480和DLD1成球能力增强,对氟尿嘧啶、顺铂和阿霉素的耐药性增强,凋亡率降低。干细胞标志物CD133、CD44和SOX-2表达明显升高。同时,Transwell迁移实验和划痕实验结果显示DAPK1敲除后细胞迁移能力明显增强,免疫荧光结果示细胞间紧密连接减少,Western blot和免疫荧光示E-cadherin和Zo-1表达降低,而N-cadherin表达升高。裸鼠皮下成瘤实验中,DAPK1敲除导致成瘤性明显增强,肿瘤中CD133表达升高,E-cadherin和Zo-1表达降低。结论:DAPK1表达降低可通过促进CRC中CSCs的干性和EMT,参与CRC的迁移和化疗耐药。第二部分DAPK1失活促进结直肠癌肿瘤干细胞干性及上皮间质转化的具体机制研究目的:明确DAPK1失活促进CRC的CSCs干性和EMT的具体分子机制。方法:Western blot、PCR及免疫荧光检测DAPK1敲除后TGF-β信号通路和Wnt信号通路激活情况,并检测可参与两种通路的锌指E-盒结合同源异形盒-1(Zinc finger E-box binding homeobox 1,ZEB1)的表达水平。在sh-DAPK1细胞系中用si RNA敲除ZEB1,成球实验检测ZEB1敲除是否可逆转由DAPK1敲除引起的成球能力升高,CCK8实验检测其对氟尿嘧啶的敏感性,流式细胞术检测细胞凋亡变化,划痕实验检测细胞迁移是否可被逆转,免疫荧光检测细胞间紧密连接的变化。并采用Western blot和PCR检测CSCs标志CD133、CD44和SOX-2,上皮细胞标志E-cadherin和Zo-1的表达变化。DAPK1抑制剂TC-DAPK6处理细胞,检测EMT和CSCs相关标志物的表达变化。结果:DAPK1敲除后,TGF-β通路TGF-β1和SMAD2表达水平升高,磷酸化SMAD2向细胞核发生移位,且TGF-β受体ACVR2A表达升高。Western blot示Wnt通路Wnt3A和核内β-catenin表达升高,PCR结果示Wnt相关蛋白、Wnt通路靶蛋白及Wnt受体表达均升高。转录因子ZEB1表达也升高。在DAPK1敲除的细胞系中敲除ZEB1可逆转DAPK1敲除的效应,导致细胞迁移能力下降,细胞间紧密连接增多,成球能力和对氟尿嘧啶的耐受性下降,细胞凋亡增多。Western blot和PCR显示干细胞标志物CD133、CD44和Sox-2表达降低,E-cadherin和Zo-1表达升高。DAPK1抑制剂并未明显影响EMT和CSCs相关标志蛋白的表达。结论:DAPK1失活通过ZEB1促进CSCs干性及EMT,DAPK1-ZEB1可能位于TGF-β通路和Wnt通路的交点,针对该靶点的治疗可能抑制结肠癌的化疗耐药和转移。