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目的:消瘀化痰饮(由丹参、郁金、泽泻、制半夏、柴胡、决明子、生黄芪、炒白术等药物组成)具有消瘀化痰、疏肝健脾功效,为导师经临床观察筛选的效方,对非酒精性脂肪肝(NAFLD)具有较好的治疗效果,为了进一步探讨其作用机理,参照相关文献运用高脂饮食复制NAFLD大鼠模型,同时施加药物干预,观察了其对NAFLD大鼠脂质代谢、肝功能的影响,探讨了其促进脂质代谢、保护肝功能的作用机制;运用免疫组化和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法观察了其对实验大鼠肝组织解偶联蛋白2(UCP2)表达的影响,探讨了其抑制UCP2过度表达的作用机制;并运用光镜和电镜观察了本方对肝组织形态学的影响。方法第一部分消瘀化痰饮对NAFLD大鼠脂质代谢和肝组织形态学的影响选用SD大鼠50只,体重160～180g,雄性。大鼠自由饮水进食,饲养于18℃～22℃明暗各24小时的清洁级动物实验室内。正常喂养1周后,随机分为5组:正常对照组(简称正常组,normal control group,N)、模型对照组(简称模型组,model group,M)、消瘀化痰饮高剂量组(简称高剂量组,high-dose Xiao-Yu-Hua-Tan-Yin group,H)、消瘀化痰饮低剂量组(简称低剂量组,low-dose Xiao-Yu-Hua-Tan-Yingroup,L)、阳性药(东宝甘泰)对照组(简称对照组,Dong-Bao-Gan-Tai control group,D)。除正常组喂饲普通饲料外,其余各组均喂饲高脂饲料。同时各用药组灌服治疗药或对照药,正常组与模型组灌服等量生理盐水,每天上午灌胃1次,每次用药体积均按1ml/100g计算,持续灌胃8周。9周末,于最后1次给药后禁食12h麻醉状态下股动脉取血,将血样低温离心,分离血清,密封,-20℃冷贮备用。于肝脏最大叶距边缘0.5cm处取0.1×0.1×0.1cm3肝组织浸泡于4%戊二醛中固定,以备电镜观察。另取少许肝组织液氮冷冻以备检测肝匀浆TG、TC ,然后取相同部位肝组织0.5×0.5×0.5cm3置于4%多聚甲醛液中固定,HE染色,以备光镜观察。第二部分消瘀化痰饮对NAFLD大鼠肝组织UCP2表达的影响实验动物分组、用药情况同前。连续喂养9周,确定脂肪肝形成后,于最后1次给药禁食12h后麻醉动物,剖取肝脏,在肝脏最大叶距边缘0.5cm处取适量肝组织置于液氮中冷冻,以备运用RT-PCR法观察肝组织UCP2mRNA的表达变化;再取相同部位0.5cm×0.5cm×0.5cm3大小的肝组织于4%多聚甲醛中固定,以备运用免疫组化法观察肝组织UCP2的表达变化;另取相同部位适量肝组织,制作肝组织匀浆测定ATP的含量。结果第一部分消瘀化痰饮对NAFLD大鼠脂质代谢和肝组织形态学的影响1消瘀化痰饮对NAFLD大鼠血清TG、TC、FFA含量的影响模型组大鼠血清TG、TC、FFA的含量(1.17±0.096、3.27±0.18、480.475±18.94)明显高于正常组(0.56±0.084、1.45±0.20、225.71±15.98)(P<0.01)。经用药干预,各用药组均能显著降低模型大鼠血清TC、TG、FFA含量,与模型组比较均具有显著性差异(P<0.01)。其中高剂量组大鼠血清TG、TC、FFA含量(0.52±0.065、1.44±0.11、221.43±15.32)和低剂量组(0.57±0.32、1.56±0.63、241.42±16.96)较对照组(0.76±0.07、2.06±0.28、331.90±16.32)均明显降低(P<0.01),而高、低剂量组之间经统计学处理无明显差异(P>0.05)。2消瘀化痰饮对NAFLD大鼠AST、ALT活性的影响模型组大鼠血清AST、ALT的活性(32.37±2.45、15.84±1.01)明显高于正常组(26.59±2.33、10.89±0.86)(P<0.01)。经用药干预,各用药组大鼠血清AST、ALT的活性均有明显的下降,与模型组比较,差异有显著性(P<0.01)。其中低剂量组AST的活性(19.45±1.90)较对照组(23.19±1.78)低(P<0.05),高剂量组ALT活性(4.16±0.89)高于对照组(7.32±0.45)(P<0.05);而高、低剂量组之间AST、ALT的活性经统计学处理无明显差异(P>0.05)。3消瘀化痰饮对NAFLD大鼠肝脏TG、TC的影响模型组大鼠肝脏TG、TC的含量(0.82±0.08、0.44±0.07)明显高于正常组(0.45±0.05、0.27±0.04)(P<0.01)。经用药干预,各用药组均能显著降低模型大鼠肝组织TG、TC的含量(P<0.01)。其中高剂量组TC的含量(0.27±0.04)低于对照组(0.34±0.05)(P<0.05),而高、低剂量组TC的含量经统计学处理无明显差异(P>0.05);各用药组TG的含量经统计学处理无明显差异(P>0.05)。4肝组织形态学改变光镜可见:正常组大鼠肝组织结构完整、清晰,肝小叶结构正常,中央静脉大而壁薄,肝细胞排列成肝索,在中央静脉周围呈放射状分布,细胞呈多边形。模型组大鼠肝细胞中度细胞水肿,少量的肝细胞坏死,多数肝细胞内可见大小不等、数量不一的脂滴空泡(脂肪变性),重度变性者,脂滴空泡融合,呈现中至重度脂肪变性,但未见明显的纤维化改变。各用药组动物肝小叶和肝血窦结构清晰,高、低剂量组肝细胞内脂滴空泡基本消失,对照组中少量的肝细胞内仍有脂滴空泡,并有轻度的细胞水肿。透射电镜可见:正常组大鼠肝脏细胞质中线粒体、粗面内质网等基本正常;模型组细胞质内充满了大、小不同的脂滴,线粒体全部脊融合、消失;粗面内质网有轻度脱颗粒现象。对照组细胞胞浆内可见大、小不等脂滴,线粒体肿胀、内质网有部分断裂现象。高、低剂量组上述情况明显改善,肝细胞胞浆有少量脂滴,线粒体形态基本正常,脊数目明显增多,仅部分可见轻度肿胀变形,内质网基本正常。第二部分消瘀化痰饮对NAFLD大鼠肝组织UCP2表达的影响1各组大鼠肝组织ATP含量的变化模型组大鼠肝组织ATP的含量(2.78±0.16)明显低于正常组(4.66±0.12)(P<0.01)。经用药干预后,各用药组大鼠ATP的含量均高于模型组(P<0.01)。其中,高、低剂量组大鼠肝组织ATP的含量(4.57±0.13、4.39±0.19)明显高于对照组(4.24±0.16)(P<0.01);高剂量组大鼠肝组织ATP的含量高于低剂量组(P<0.01)。2各组大鼠肝组织UCP2表达的变化半定量分析显示:模型组大鼠肝组织UCP2表达的平均灰度(0.0883±0.0079)明显低于正常组(0.2170±0.0106)(P<0.01)。经用药干预后,各用药组大鼠肝组织的平均灰度均高于模型组(P<0.01)。其中,高、低剂量组平均灰度(0.1627±0.0130、0.1310±0.0046)高于对照组(0.1103±0.0064)(P<0.01);高剂量组平均灰度高于低剂量组(P<0.01)。3各组大鼠肝组织UCP2mRNA表达的变化RT-PCR后,琼脂糖凝胶电泳,在479bp、587bp处分别显示出UCP2mRNA和β-actin电泳带,与预期结果一致。模型组大鼠肝组织UCP2mRNA的表达(0.4065±0.0281)显著高于正常组(0.0944±0.0102)(P<0.01)。给药后,各用药组UCP2mRNA的表达显著低于模型组(P<0.01),其中,高、低剂量组UCP2mRNA的表达(0.1846±0.01301、0.1790±0.0134)低于对照组的表达(0.2669±0.0208)(P<0.01),而高、低剂量组之间无显著性差异(P>0.05)。结论1消瘀化痰饮能显著降低NAFLD大鼠血清和肝组织内异常升高的TC、TG、FFA的含量,抑制血清内ALT和AST活性的异常升高,呈现出良好的调脂护肝作用。2消瘀化痰饮可明显改善NAFLD大鼠肝组织的病变程度,表现为用药后大鼠肝小叶和肝血窦结构清晰,肝细胞内脂滴空泡基本消失;线粒体形态基本正常,脊数目明显增多。3消瘀化痰饮能抑制NAFLD大鼠肝组织UCP2的过度表达,增加ATP的合成和线粒体的能量贮备,促进脂肪酸代谢,以达到治疗NAFLD的目的。