Sohlh2(spermatogenesis and oogenesis specific basic helix-loop-helix2)是bHLH(basic helix-loop-helix)转录因子超家族的成员,是启动原始卵泡发育的关键基因之一,制备转有Sohlh2基因的动物具有重要的科研价值和应用价值。而在制备转基因动物的方法中,精子载体法以操作简单,人为机械损伤较少的优点,受广大研究者的瞩目。与此同时,精子载体法阳性率不高的问题得不到妥善解决,需要在精子载体法的基础上提高外源基因进入精子的效率,以达到提高阳性率的目的,细胞穿膜肽就是一种较好的解决方案。穿膜肽是由不多于30个氨基酸残基组成的小分子多肽,具有很强的跨膜转运能力。本研究拟比较细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPPs)用于不同细胞转染的转染效率,之后探讨将筛选的CPPs用于精子载体法制备转Sohlh2基因猪胚胎的可行性。具体研究结果如下。1.Sohlh2基因全长编码区序列片段的克隆。基因包含全长编码序列的扩增片段大小为1281bp,应用MEGA和ORF Finder等程序对所得序列进行相关生物信息学分析。多重序列比较结果显示,水牛与黄牛、绵羊、猪、人、小鼠Sohlh2基因氨基酸的相似性分别为98%、96%、85%、81%和81%,在氨基酸和核苷酸水平上Sohlh2基因在不同物种中具有较高保守性。蛋白二级结构分析结果显示Sohlh2蛋白由α一螺旋、p一折叠、p一转角及无规则卷曲组成,蛋白有自己独特的结构域。2.水牛Sohlh2基因表达模式的研究。应用qRT-PCR技术,检测了Sohlh2基因在水牛不同组织的表达。结果显示,水牛Sohlh2在睾丸中表达丰度最高。之后构建Sohlh2基因的慢病毒表达载体,然后采用倍比稀释法测定包装出来的病毒滴度,检测得病毒滴度已经达到106,达到了要求。3.穿膜肽在不同细胞以及精子上的转染效率的探讨。首先探讨不同孵育液、温度、以及孵育时间下质粒与穿膜肽孵育之后转染293T细胞的情况,以得到最佳的反应条件。结果显示,在37℃下Sohlh2基因质粒与穿膜肽在无血清无双抗的DMEM溶液孵育20min转染效果最佳。其次是流式细胞仪检测不同穿膜肽的转染效率。结果显示,脂质体的转染的效率最高,达到87.72%。C105y、Mpg、Tat、Pep-1和Pep-3穿膜肽的转染效率分别为48.61%、42.90%、8.03%、3.36%和1.98%,效率对比脂质体略低。最后是探讨不同液体和孵育温度下精子的转染效率,最佳反应条件为用无血清无双抗的DMEM作为孵育液体,在37℃培养箱孵育20min。应用激光共聚焦技术观察精子发光,结果显示,精子发光部位集中在顶体后区。4.利用穿膜肽和慢病毒进行IVF制备转Sohlh2基因猪胚胎。首先通过检测穿膜肽,脂质体和慢病毒处理精子对精子活率、平均曲线运动速度(VCL)、平均直线运动速度(VSL)和前向性(STR)等试验指标的影响。结果显示,穿膜肽C105y对精子平均直线运动速度、平均曲线运动速度和精子前向性的影响与对照组相比,差异都不显著(P>0.05)。之后,选择慢病毒和C105y进行IVF生产转Sohlh2基因猪胚胎。C105y组的囊胚率显著高于慢病毒组(15.8±6.9vs9.1±3.5,P<0.05),和对照组差异不显著(15.8±6.9vs13.8±5.0,P>0.05),但C105y组的阳性率低于慢病毒组(8.54±0.78vs10.38±0.95,P<0.05)。结论：1.以水牛卵巢和睾丸的混合cDNA为模板,可克隆得到水牛Sohlh2基因,并能用于构建Sohlh2基因的慢病毒载体。2.穿膜肽C105y与Mpg在37℃下以无血清无双抗的DMEM溶液孵育20min后可有效将Sohlh2基因质粒转染到细胞和精子内,但效果比脂质体组差。3.穿膜肽C105y对精子活率、平均曲线运动速度(VCL)、平均直线运动速度(VSL)和前向性(STR)各项指数无显著影响,是一种理想的IVF穿膜肽载体。4.采用穿膜肽C105y和慢病毒转染精子进行IVF均可以得到转Sohlh2囊胚。