肿瘤能够通过多种机制诱导免疫抑制细胞的产生来介导机体免疫抑制,这是造成肿瘤免疫逃逸非常重要的机制,也是肿瘤免疫治疗失败的主要原因。近年来,越来越多的研究发现,肿瘤患者体内存在着一群具有免疫抑制功能的髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)。 MDSCs是一群骨髓来源的、未成熟的异质性髓系细胞,包括粒细胞样MDSCs(G-MDSCs)和单核细胞样MDSCs (M-MDSCs)。在健康个体体内,MDSCs从骨髓产生之后能够迅速分化为树突状细胞(dendritic cell, DC).巨噬细胞和粒细胞。在病理状况下,MDSCs的分化过程受阻,大量积聚于体内。在肿瘤患者体内,MDSCs能够负向调节免疫应答,有效地抑制CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞的抗瘤免疫效应,促进肿瘤的生长。MDSCs在肿瘤诱导的免疫抑制中发挥重要作用,严重阻碍了肿瘤免疫治疗的效果。目前人们主要通过清除MDSCs、阻断MDSCs的免疫抑制功能或者促进MDSCs分化成熟等方法来实现靶向MDSCs的免疫治疗p-葡聚糖是许多植物、微生物细胞壁的组成成分,包括燕麦、海藻、真菌、酵母以及某些细菌等。p-葡聚糖作为一种免疫调节剂,具有正向免疫刺激作用和抗肿瘤活性,但对其作用机制尚不十分清楚。目前的研究主要发现β-葡聚糖通过对DCs、巨噬细胞以及中性粒细胞的调控来增强天然免疫应答和适应性免疫应答,而关于p-葡聚糖对免疫抑制细胞的作用尚不清楚。那么,β-葡聚糖能否对MDSCs的生物学活性进行调控呢?因此,我们采用酿酒酵母来源的颗粒型p-葡聚糖(whole β-glucan particles, WGP)来研究其对MDSCs的调控作用。MicroRNA (miRNA)是一种非编码的、内源性的小分子RNA,它能够特异性地与靶基因mRNA上3’非编码区(3’UTR)的互补序列结合,从而阻止蛋白的合成。miRNA在体内参与多种细胞的发育、成熟、增殖、分化和凋亡。miRNA还可从细胞的分化、功能、存活以及细胞因子的释放和胞内信号传导等方面调控多种免疫细胞参与天然免疫应答和适应性免疫应答。目前已经发现多种miRNA参与免疫细胞的调控,而对于调控MDSCs生物学活性的miRNA研究甚少,仍需我们进一步地探究。基于以上分析,我们对所提出的问题进行了系统的研究。分别探讨了p-葡聚糖对MDSCs分化和功能的调控,挖掘调控作用的潜在机制；探究与p-葡聚糖调控MDSCs有关的miRNA,并进一步揭示miRNA的作用机制,旨在寻求具有潜在临床应用价值的肿瘤免疫治疗新靶点。一、WGP通过调控M-MDSCs的分化与功能来增强抗瘤免疫应答本部分的目的是明确WGP能否对MDSCs进行调控,若可以,进一步探讨具体机制。为了观察WGP对MDSCs的作用,我们首先检测MDSCs表面是否表达p-葡聚糖的受体Dectin-1。结果发现在M-MDSCs和G-MDSCs表面均表达Dectin-1。这就说明p-葡聚糖能够直接作用于MDSCs。接着,我们采用WGP作用于MDSCs,发现WGP能够通过Dectin-1途经促进M-MDSC分化为更为成熟的髓系细胞,这群细胞表型为CD11c+F4/80+Ly6Clow,且高表达CD40, CD80, CD86以及MHCII分子。进一步研究发现该诱导分化过程是依赖于NF-κB途经的。另外,WGP刺激后的M-MDSCs的免疫抑制能力明显降低。利用荷瘤小鼠模型发现,给予荷瘤小鼠口服WGP后,肿瘤的发展进程明显减缓。小鼠体内脾脏以及肿瘤组织局部中的MDSCs显著减少,而局部引流淋巴结和肿瘤组织中的DCs和巨噬细胞的比例显著上升；另外,脾脏、淋巴结和肿瘤组织中浸润的CD4+IFNγ+Th1细胞和CD3+CD8+IFNγ+CTL细胞明显增多,肿瘤组织中的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)显著减少,而脾脏和淋巴结中的Treg细胞比例与对照组相比并无明显变化,但是其免疫抑制功能明显下调。我们的结果表明WGP能够通过Dectin-1途经促进M-MDSCs的分化与成熟,降低其免疫抑制能力,而这一作用是依赖于NF-κB途经的。体内发现WGP能够通过降低MDSCs的比例,增加DCs和巨噬细胞的比例,进而增强Thl和CTL细胞反应,降低Treg细胞的抑制能力,从而延缓肿瘤的发展。二、miR-9通过靶向Runxl的表达来调控MDSCs的成熟分化与功能接下来,我们进一步探讨调控MDSCs分化成熟和功能的分子机制。首先,我们发现WGP能上调MDSCs中Runx1的表达,而经研究发现Runx1又与MDSCs的成熟和功能密切相关,Runx1能够促进M-MDSCs的成熟且降低其免疫抑制能力。接着,我们采用miRNA芯片检测方法寻找可能调控MDSCs成熟和功能的miRNA。经miRNA表达谱分析以及筛选发现,WGP刺激M-MDSCs和G-MDSCs后,miR-9的表达量明显降低,且预测结果显示Runx1很可能是miR-9作用的靶基因。经荧光素酶报告基因检测分析,证实了miR-9与Runx1之间的靶向关系。另外,我们还发现miR-9的表达受转录因子CREB的调控,CREB能够结合到pre-miR-9-1的启动子上,调控miR-9的表达。接下来,我们将miR-9拟似物或抑制剂转染至MDSCs中研究miR-9对MDSCs的调控作用。我们发现过量表达miR-9能够明显增强MDSCs的免疫抑制活性,抑制WGP诱导M-MDSCs的分化过程；相反地,下调MDSCs中的miR-9则可以促进M-MDSCs的成熟,而削弱MDSCs的免疫抑制能力。为了在体内观察miR-9对MDSCs的调控,我们建立了小鼠Lewis肺癌移植瘤模型,将转染了miR-9拟似物或抑制剂的MDSCs局部注射入小鼠体内后,与对照组相比,抑制了MDSCs中miR-9表达后荷瘤小鼠的肿瘤生长缓慢,小鼠的存活率明显增高；相反地,增加MDSCs中miR-9的表达能够促进肿瘤的生长,显著降低小鼠的存活率。此外,直接注射miR-9抑制剂于小鼠肿瘤局部,也能够达到延缓肿瘤的效果。临床研究发现肺癌患者肿瘤组织中存在大量MDSC的浸润,在肺癌患者肿瘤组织以及外周血中miR-9呈高水平表达,且与MDSC的主要效应分子精氨酸酶的含量有较好的正相关性,提示miR-9具有用于临床肿瘤治疗新靶点的潜在应用价值,以及作为临床肿瘤诊断的新指标。上述结果表明WGP通过下调CREB的表达,进而下调miR-9的表达,而miR-9又通过靶向Runxl的表达来调控MDSCs的分化成熟与功能。体外下调MDSCs中的miR-9可以促进M-MDSCs的成熟,而削弱MDSCs的免疫抑制能力。体内抑制MDSCs中miR-9的表达可以有效地延缓肿瘤的发展进程,延长小鼠的生存时间。这些数据均表明了miR-9具有作为肿瘤免疫治疗新靶点的潜在应用价值。综上,通过两部分实验内容,我们研究了β-葡聚糖对MDSCs分化与功能的调控作用及其机制,证明了WGP能够通过Dectin-1途经诱导M-MDSCs的分化和成熟,降低MDSCs的免疫抑制能力,从而增强抗瘤免疫应答。进一步研究发现,WGP主要是通过下调MDSCs中miR-9的含量,继而靶向Runxl的表达来调控MDSCs的分化成熟和功能,抑制MDSCs中miR-9的表达能够有效地延缓肿瘤的生长。该研究从新的角度揭示并丰富了β-葡聚糖的作用机制,阐述了p-葡聚糖对抑制性细胞MDSCs的作用,从miRNA分子角度探讨了调控MDSCs分化和功能的新机制,为肿瘤的临床免疫治疗挖掘了新的治疗靶点和治疗策略。