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植物受到病虫的攻击后,能直接或间接诱导体内一系列防御反应的信号转导途径关键酶合成基因的表达,启动相关的防御信号转导途径,激活植物自身防御系统,达到自我保护。茉莉酸类化合物是一类新发现的植物内源生长物质和信号分子,在植物生长发育过程和各种逆境条件下起重要的调节作用。茉莉酸(jasmonate acid,JA)信号转导途径是当前信号转导途径的研究热点之一。丙二烯氧化物合成酶基因(allele oxide sysnthase,AOS)是JA生物合成的关键酶基因,也是影响JA信号途径的调控基因。COⅡ是JA信号途径中分离的第一个重要调控基因,也是目前所有依赖JA响应所必须的基因。由于植物各种信号转导途径交叉形成的网络结构,研究与信号途径有关的关键基因,如以水稻RCOI和OsAOS基因为切入点,有可能更深入了解整个信号转导途径。RNA干涉(RNA interfererice,RNAi)作为一项新的生物学技术,能够通过基因转录后的调控,抑制特定基因表达,从而推断该基因的功能。
本研究的目的是将RNAi方法引入分子生态学,利用RNAi技术干涉水稻的RCOⅠ和OsAOS基因,获得转基因植株种子。然后通过RT-PCR方法分析干涉RCOT和OsAOS基因后水稻其他相关防御基因的表达情况,从而反向研究RCOI和OsAOS基因的功能,为JA信号途径的深入研究开辟新途径。
本研究所用的方法和步骤是首先抽提水稻RNA,反转录得到cDNA,同时设计引物获得水稻RCOI和OsAOS目的片段,并提取载体质粒DNA。将目的基因片段和质粒通过两轮装载,构建RNA干涉载体。通过电极转化将干涉载体转到根癌农杆菌中。再由农杆菌介导转化水稻愈伤组织,筛选并鉴定得到转基因植株,对部分转基因植株后代的性状进行简单分析。最后,对T<,0>代RCOI转化植株和部分T<,1>代OsAOS转化植株进行PCR和Southern杂交检测,证明目的片段已整合至水稻基因组中,并且结合RT-PCR分析,研究RCOI和OsAOS基因被干涉后对水稻的其他主要防御基因表达的影响。
研究所获得的主要结果包括成功构建RCOI和OsAOS的RNAi载体,并证明其载体在大肠杆菌和农杆菌中都能稳定表达:通过农杆菌介导转化水稻愈伤组织,得到RCOI和OsAOS干涉后的转基因植株,并收获部分种子;利用离体叶片潮霉素快速鉴定、潮霉素PCR和SOLlthern杂交等方法对转基因植株后代进行鉴定,证明了RCOI和OsAOS基因的片段正确插入水稻基因组;利用RT-PCR对部分转基因植株目的基因的mRNA表达量进行分析,结果表明了大部分的mRNA被降低,有的甚至被完全干涉,应当是由RNAi引起;最后通过对四个防御基因的表达分析,初步探讨RCOI和OsAOS两个基因的功能,认为RCOIO和sAOS基因是JA信号转导途径上的关键基因,一旦被干涉,会引起相关防御基因表达水平的变化。