论文部分内容阅读
家蚕不仅是重要的经济昆虫,也是遗传学和分子生物学等研究的重要实验动物。在人类数千年的养蚕历史中,通过自然选择和人工诱导,家蚕积累了丰富的可稳定遗传的突变资源,涉及躯体附肢发育、体色及斑纹、体形体态、变态发育等,在蚕学及生物学基础研究等领域均具有极其重要的价值。
E群突变是家蚕中存在的一个拟复等位基因群,被定位在第6连锁群的21.1位点,是发生遗传学研究的良好材料。迄今为止发现的E群突变达30多个,它们的突变表型均与斑纹及附肢的过剩或缺失、体节及器官畸形等有关,其中多数成员还表现为纯合体胚胎致死。近年来,已经证实了E群附加半月纹突变(ECa)中abd-A基因缺失,而在新附加半月纹突变(EN)中Ubx和abd-A基因均有缺失:通过精细定位,Kp过剩肢突变(EKP)的候选基因被锁定为abd-A基因;另外,在Mu过剩肢突变(EMu)中Abd-B基因的表达部位也发生了一定的改变。因此,E群突变与在昆虫躯体模式发育过程中起重要作用的Hox基因有着密切的联系。
三重半月纹突变(ETc)为家蚕E群突变之一,其表型为:第4、5、6环节生半月纹,第8环节缺星状纹,纯合型完全无腹足,胚胎期半致死。对家蚕三重半月纹突变的研究,有利于了解家蚕E群突变在发育过程中相关基因的分子调控机制。本研究基于家蚕经典遗传图谱、家蚕基因组精细图谱,利用生物信息学分析、定位克隆、qRT-PCR、原位杂交等技术对家蚕三重半月纹突变(ETc)形成的分子机制进行研究。获得的主要结果如下:
1.家蚕三重半月纹突变(ETc)的形态特征观察
利用电子显微镜观察胚胎发育至第8天的家蚕Dazao和三重半月纹纯合型胚胎,发现三重半月纹纯合型胚胎第3腹节(A3)到第6腹节(A6)体节无附肢生长。即使微弱的凸起也未发现,证实三重半月纹纯合型胚胎完全无腹足。观察5龄第3天的家蚕Dazao和三重半月纹杂合型幼虫,三重半月纹第4、5、6环节生半月纹,第8环节缺星状纹。
2.家蚕E群突变三重半月纹ETc基因的分子定位
选用家蚕基因资源库的突变系统材料ETc(06-720)和大造作为亲本。配制连锁分析组合(BC1F,F1雌回交隐性亲本)和定位分析组合(BC1M,F1雄回交隐性亲本)。利用属于家蚕第6连锁群的13对SSR引物和设计的染色体步移标记筛选多态性标记。用筛选到的多态标记对BC1F群体22个个体基因组进行连锁验证,并利用BC1M群体的192个突变个体进行初步定位分析,得到遗传距离为7.5cM的分子连锁图,标记M-2与M-5与ETc座位紧密连锁,这两个标记在Bmabd-A基因上游约8.8kb处,而距离其它基因均很远,据此我们将Bmabd-A基因确定为家蚕三重半月纹突变的候选基因。
3.家蚕abd-A基因(Bmabd-A)生物信息学分析
基于NCBI和家蚕基因组数据库,对家蚕abd-A基因进行生物信息学分析,它位于家蚕第6号染色体的nscaf2853上,Bmabd-A基因有三种剪接方式:Bmabd-A-L型的ORF为1059bp,编码352个氨基酸,预测其蛋白质的pI/Mw:9.43/38.3KDa:Bmabd-A-S型的ORF为1044bp,编码347个氨基酸,预测其蛋白质的pI/Mw:9.51/37.6Kda:Bmabd-A-3型的ORF为1032bp,编码343个氨基酸,预测其蛋白质的pI/Mw:9.59/37.2Kda。在线预测蛋白质结构域分析发现,家蚕Bmabd-A含有一个同源异型结构域(Homeodomain)。系统发生分析显示,昆虫中abd-A、Ubx和Abd-B基因分别形成一个单独的进化枝,表明abd-A,Ubx和Abd-B基因在昆虫进化中具有高度的同源性,暗示它们的功能在不同昆虫中有重要作用。
4.家蚕Bmabd-A基因的时期和组织表达特征
RT-PCR结果显示,Bmabd-A基因在胚胎期1天开始表达,胚胎期4、5天时表达量最高,之后有所下降:Bmabd-A基因在家蚕5龄3天的马氏管、生殖腺、脂肪体和中肠中均高量表达。由此表明,Bmabd-A基因在胚胎早期就参与家蚕的生长发育调控,另外该基因可能与马氏管、脂肪体、中肠等多种组织的发育有关。
5.家蚕Bmabd-A基因在野生型和突变型中的序列及表达差异分析
通过基因克隆技术克隆Etc突变中Bmabd-A基因的编码区,将Dazao、Etc中Bmabd-A基因序列进行比对,并在线预测它们的结构,并未发现Bmabd-A基因在CDS和三级结构上的差异。
同时,通过qRT-PCR发现,Bmabd-A基因的表达量在三重半月纹(Etc/Etc)突变中明显降低,这与家蚕abd-A基因表达量降低时腹足不能正常发育一致。我们推测在Etc中Bmabd-A基因表达量降低,影响家蚕腹足生长相关的基因及调控因子,使得Etc而纯合体胚胎腹足缺失。
6.家蚕Bmabd-A内含子调控区域分析
在ETc中克隆Bmabd-A基因,发现其第一内含子区域存在6处不同片段大小的缺失,共99bp。对缺失区域的序列特征进行在线分析(http://www.genomatix.de),发现此缺失片段中,含有6个Hox基因转录因子结合位点.我们推测三重半月纹可能由于丢失这些Hox基因转录因子结合位点,使得Bmabd-A基因的转录水平降低。最终导致三重半月纹纯合型胚胎完全无腹足。
7.家蚕Bmab-A基因的胚胎期原位杂交
为了清楚的了解Bmabd-A基因在家蚕三重半月纹突变纯合型胚胎中的表达部位,我们在克隆的基础上合成特异的地高辛标记的RNA探针,利用家蚕胚胎期材料进行原位杂交实验。用RNA探针的反义链进行杂交,用正义链做对照,结果显示在家蚕腹部A1-A6体节有明显的浅棕色杂交信号,在第三胸节(T3)后部和腹部A7-A10体节有微弱的杂交信号,这与相关文献报道昆虫中abd-A基因的表达部位一致。