【摘 要】
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本研究室于2008年建立了Kctd10基因敲除的小鼠模型,2014年发表的研究结果发现Kctd10基因全敲除小鼠(KCTD10-/-)表现出严重的心脏AVC瓣膜缺陷和血管形成抑制,第10.5天的胚胎（E10.5）致死。血管内皮细胞是血管形成中起主要功能的效应细胞及Kctd10全敲除纯合子突变小鼠胚胎早期死亡,不利于研究Kctd10在小鼠血管形成中的作用及分子机制。因此在本研究中,我们首先将Kctd
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本研究室于2008年建立了Kctd10基因敲除的小鼠模型,2014年发表的研究结果发现Kctd10基因全敲除小鼠(KCTD10-/-)表现出严重的心脏AVC瓣膜缺陷和血管形成抑制,第10.5天的胚胎（E10.5）致死。血管内皮细胞是血管形成中起主要功能的效应细胞及Kctd10全敲除纯合子突变小鼠胚胎早期死亡,不利于研究Kctd10在小鼠血管形成中的作用及分子机制。因此在本研究中,我们首先将Kctd10Loxp/Loxp敲除小鼠与内皮细胞特异性表达的Tek-Cre转基因小鼠进行交配,经基因型鉴定,筛选获得Kctd10内皮细胞特异性敲除杂合子小鼠(Kctd10flox/-;Tek-Cre);分离第E7.5、E8.5、E11.5天的胚胎,发现Kctd10血管内皮细胞特异性敲除小鼠(Kctd10flox/flox;Tek-Cre)在第8.5天的胚胎（E8.5）致死;采用组织免疫荧光检测Kctd10对出生后第五天杂合子小鼠视网膜血管的影响,发现KCTD10的敲低对血管的分支和出芽有抑制作用。为了进一步确认Kctd10对血管形成的影响,我们考虑Kctd10对于血管形成的影响可能还通过其它非血管组织影响血管的生成。因此,我们将Kctd10Loxp/Loxp敲除小鼠与视网膜神经元和胶质细胞特异性表达的Six3-Cre转基因小鼠进行交配,经基因型鉴定,获得Kctd10视网膜特异性敲除小鼠(KCTD10flox/flox;Six3-Cre);然后分离Kctd10视网膜特异性敲除小鼠的视网膜,通过q RT-PCR和WB实验分析KCTD10基因的表达,确认Kctd10视网膜特异性敲除小鼠的制备;采用组织免疫荧光检测Kctd10对P5小鼠视网膜血管的影响,发现KCTD10的敲除对血管的长度、密度、分支、出芽和丝状伪足的形成有抑制作用。最后,我们取两种敲除鼠P5天视网膜的RNA和蛋白,用qRT-PCR法检测了18个与血管生成相关基因的表达。VEGFR1、FGFR3、Bmp2和Robo4的表达相比较于野生型小鼠组明显上调。我们选取Robo4用于后续的研究,用蛋白质印迹实验进一步证实了Robo4的表达上调而p-AKT的表达水平下调。同时,在人脐静脉内皮细胞中构建了KCTD10稳定表达细胞系,检测Robo4、p-AKT的表达。结果表明过表达KCTD10会抑制Robo4而上调p-AKT的表达。综上,我们的研究揭示了内皮细胞和视网膜特异性敲除Kctd10,会抑制血管形成且内皮细胞特异性敲除Kctd10小鼠胚胎早期死亡,KCTD10的敲除可以促进Robo4的表达,下调p-AKT的表达进而抑制血管形成,为血管相关疾病的检测和治疗提供了理论指导。
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