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目的:
CCDC154是一个全新的功能基因。前期工作中,我们发现CCDC154与石骨症相关,但其具体的生物学功能目前仍不清楚。为了深入探讨CCDC154基因的生物学功能,我们克隆人CCDC154基因,并通过体外实验研究该基因的生物学特性、功能及其作用的分子机理。
方法:
1)从HEK293细胞中提取总RNA,利用RT-PCR技术克隆CCDC154编码序列,利用生物信息学工具分析其结构;
2)构建CCDC154真核表达载体,在HEK293及Hela细胞中瞬时或稳定高表达CCDC154基因,利用克隆形成、MTT、软琼脂等实验检测CCDC154在细胞生长调控中的作用。
3)通过流式细胞技术检测细胞周期及Western Blot检测相关蛋白表达,分析CCDC154基因调控细胞生长的分子机理。
4)构建不同的CCDC154基因缺失突变体,通过克隆形成实验检测CCDC154调控细胞生长的结构域。
结果:
1)成功克隆了CCDC154编码序列,长2001 bp,编码667个氨基酸。蛋白结构域分析发现,CCDC154含有多个coiled-coil domain和周期蛋白结合域。
2)在HEK293和Hela细胞中瞬时过表达CCDC154显著抑制细胞生长。CCDC154过表达细胞形成的克隆数目明显减少;MTT细胞活性测定显示,CCDC154过表达细胞的生长活性明显降低。
3)稳定过表达CCDC154显著抑制HEK293和Hela细胞生长,并且体外成瘤显示,稳定过表达CCDC154明显抑制Hela细胞形成的克隆大小。
4)细胞周期分析结果显示,稳定过表达CCDC154导致HEK293细胞在G2/M期发生阻滞,G2/M期细胞数目提高两倍以上。
5) Western Blot结果显示,过表达CCDC154导致HEK293细胞周期相关蛋白Cyclin B1,Cdc2表达下调,p21、Chk1表达上调。
6)缺失突变体研究发现含有2个周期蛋白结合域的CCDC154片段具有与全长CCDC154相似的抑制细胞生长活性,而不含周期蛋白结合域的CCDC154片段则不具有抑制活性。
结论:
过表达CCDC154基因可抑制HEK293细胞生长,这与其导致细胞周期G2/M停滞有关。CCDC154抑制细胞生长的作用也发生在癌细胞中,提示其是一个潜在的肿瘤抑制基因。