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研究背景：点状掌跖角化病(Punctate palmoplantar keratoderma,PPKP)为一组病因复杂的常染色体显性遗传性皮肤病。其主要临床表现为分布于掌跖部位的圆形或卵圆形的硬性角质性丘疹,可以融合成片。根据连锁定位区域和临床特征的不同,人类孟德尔遗传在线(Online Mendelian inheritance in Man database,OMIM)收录了PPKP的3种不同类型,分别为连锁定位区域为15q22的PPKP1(Buschke-Fischer-Brauer type; MIM148600),目前无任何定位信息的PPKP2(Porokeratotic type; MIM175860)以及定位于2p25–p12染色体区域的PPKP3(Acrokeratoelastoidosis type; MIM101850)。2004年,本课题组在一个中国汉族人PPKP1家系中定位了染色体区域15q22.2-15q22.31与本病相关。 播散浅表性光化性汗孔角化症(Disseminated superficial actinic porokeratosis,DSAP)是一组以环状排列的异常角化性皮损为特征表现,主要发生在曝光部位的常染色体显性遗传性皮肤病,它是汗孔角化症中最为常见的一种类型。通过传统的以家系为基础的全基因组连锁分析研究已经发现了5个DSAP的易感区域:12q23.2-24.1,12q24.1-q24.2,15q25.1-26.1,1p31.3-p31.1和16q24.1-24.3。2012年,本课题组使用全基因组外显子测序在一中国汉族DSAP家系中首次发现了MVK致病基因。同时在另外的18个DSAP家系和4个DSAP散发病例中检测出MVK基因的13种突变形式。DSAP表现很强的异质性,在所有选入研究的DSAP病例中,仍有很大一部分未能成功克隆出致病基因。 目前,全基因组外显子测序在单基因病致病基因研究中被广泛应用,它具有所需样本少,周期短,覆盖面广和准确度高等优点,已经发展成为发现小样本罕见遗传病致病基因的最有效手段。 目的：对定位于染色体15q22.2-15q22.31区域的点状掌跖角化病和非MVK基因致病性的播散浅表性光线性汗孔角化症使用全基因组外显子测序进行研究。(2)全基因组外显子测序发现的候选基因在更多样本中进行验证,确认致病基因。 方法：(1)分别从安徽医科大学皮肤病研究所遗传资源库中选择具有典型临床表现的点状掌跖角化病和播散浅表性光化性汗孔角化症家系样本和散发病例。在之前定位过染色体15q22.2-15q22.31区域的点状掌跖角化病家系中选择1例患者和1例正常对照。在1例未能克隆出MVK基因的播散浅表型光线性汗孔角化症家系中选择2例患者和1例对照,抽提外周血DNA。(2)纯化后的基因组DNA被随机打断来建立DNA文库,在DNA片段两端接上接头后进行纯化。(3)使用接头连接DNA片段做为模板进行连接介导的PCR,使用SureSelect Biotiny lated RNA Library对外显子片段进行富集,并洗脱。(4)使用HiSeq2000高通量测序仪对富集过后的PCR产物进行双末端测序,得到最初的原始图像文件。(5)使用Illumina basecalling Software1.7软件对原始图像文件读取,并使用SOAPaligner2.20软件与人类参照基因组(NCBI build37.3,hg19)进行比对。(6)分别通过SOAPsnp(v1.03),GATK(Genome analysis toolkit)识别SNP和插入/缺失变异。(7)通过与dbSNP137,1000 Genome,HapMap,内部数据库以及病例对照比对等方式过滤掉常见变异。(8)首先选择位于连锁定位区域内的候选变异位点,在其它样本中使用Sanger测序进行验证。(9)如果原连锁区域内未找到变异位点或在外显子组测序家系内未能验证出基因型-表型共分离位点,将筛选范围扩大至整个外显子组,使用功能预测软件如SIFT,PolyPhen来选择可能有害变异位点在其它样本中进行验证。 结果：5例样本进行全基因组外显子测序所获得的靶向外显子组覆盖度达到98～％,平均测序深度达到70×~,每例样本在与人类参考基因组比对注释之后能够平均得到1.35×105个功能性变异,与其它常见变异数据库以及病例对照筛查之后,在PPKP1家系和DSAP家系分别得到527和233个变异位点。 在PPKP1-1家系中我们发现位于5个基因上的5个变异位点位于定位区域15q22.2-15q24.1内,Sanger测序确定该定位区域内AAGAB基因上的c.552_554TAG>AT(p.Phe184Leufs*6)变异为该家系致病变异。随后在4个独立家系以及1例散发病例中发现了AAGAB基因的5种突变形式,验证了AAGAB致病基因。 筛选DSAP的连锁区域内的变异位点,发现了位于4个基因上的4个变异,在家系内使用Sanger测序进行基因分型,由于不符合表型一致性而全部排除。进而将筛查范围扩大至外显子组,使用SIFT,Polyphen软件进行预测,获得了25个可能有害的变异位点,在家系内进行验证,发现位于SLC17A9基因上的c.932G>A(p.Arg311Gln)在家系内符合基因型表型共分离。在未携带MVK基因变异的DSAP患者中选择7个独立家系(Family1-7)和19例散发对SLC17A9基因的所有编码外显子以及侧翼序列进行测序,在Family2家系内发现了SLC17A9基因的第二种变异c.25C>T(p.Arg9Cys),验证了SLC17A9致病基因。 结论：本研究利用全基因组外显子测序在点状掌跖角化病和播散浅表性光化性汗孔角化症找寻致病基因,在染色体15q22.2-15q24.1区域定位PPKP1家系内发现了致病基因AAGAB,在一DSAP家系内发现了致病基因SLC17A9。该研究不仅在基因水平阐明了部分PPKP1和DSAP的发病机制,而且证实了使用外显子测序技术在拥有异质性的单基因遗传病中找寻不同致病基因的可行性和可靠性。基因型表型关联研究可以更好的指导疾病预防和临床治疗。