研究背景大段骨缺损容易导致骨的延迟愈合或不愈合,是外伤造成残疾的常见原因。由此带来的家庭、经济和社会问题不容忽视。自体骨移植一般被认为是治疗的金标准,但它也存在明显局限性。随着骨组织工程技术的发展,骨缺损的治疗有了新的选择。骨组织工程支架材料作为骨的临时性替代物被植入缺损部位,要求它具有接近于自体骨的生物学特性。因此,寻找合适的骨替代材料就成为骨组织工程要解决的首要问题。有机高分子聚合物材料聚乳酸(Poly-lactide acid, PLA)以其优良的生物相容性和热稳定性、可控的机械强度、可降解且降解产物无毒等特性,早在上世纪70年代就被美国FDA批准用于临床。其中,消旋聚乳酸(Poly-D,L-lactide acid, PDLLA)降解速率较快,更适宜选作骨组织工程支架材料。然而,PDLLA表面缺乏能与细胞跨膜整合素受体结合的生物活性位点。另外还存在亲水性差、细胞吸附力弱等问题,难以提供细胞和材料间交互作用的理想环境。针对这些问题,已有很多学者尝试对PDLLA进行表面修饰。常用方法如表面涂层、表面化学修饰、等离子体改性等。表面涂层通常在材料表面覆盖细胞外基质蛋白涂层,以模拟天然的细胞环境。缺点是耗时且造价昂贵,被动的吸附可能竞争性抑制其它物质的吸收,可能改变涂层蛋白的分子构型,最终导致生物活性被抑制或降低。化学修饰的目的也是为了在人工支架材料表面引入生物活性分子,相比单纯的物理吸附,材料表面能与生物活性分子间的化学键结合,结合效率更高,更为牢固。化学修饰采用的各种偶联技术确保活性肽与材料表面的共价接合,但仍面临两个问题：(1)聚合物材料表面通常缺乏适宜的活性基团；(2)化学反应过程繁琐且不易控制,反应试剂难以彻底除去,可能破坏材料内部结构。等离子体改性技术能够在不影响整体机械性能的前提下对材料表面进行修饰。它能够提高材料的粗糙度和表面能,并改善材料的亲水性。利用特定的气体,可以在材料表面引入特定的官能团,如氨基(-NH2)、羟基(-OH)等,这就为进一步接合生物活性分子(如胶原、活性肽段等)创造了条件。与化学修饰方法相比,等离子体改性具有工艺简单、易控制、无污染、不影响材料的整体性能、材料表面形状不受限制和较强的灭菌消毒性能等优点。同时,它也存在活性基团会随时间消逝的问题。生物活性人工骨支架,亦所谓“仿生”支架,是在体外构建具备体内的细胞外基质环境的支架材料。早期学者们自然想到利用细胞外基质(extracellular matrix, ECM)蛋白,如胶原(collagen)、层粘连蛋白(laminin, LN)、纤连蛋白(fibronectin, FN)等进行材料表面涂层。后来发现,天然ECM蛋白分子易发生折叠而影响受体的识别,而来源于ECM蛋白长链上的短肽序列比天然长肽更稳定,便于人工合成且效率较高。因此,研究开始倾向于在材料表面接枝活性短肽。最常用的肽序列是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD),它来源于ECM蛋白上的功能区域,是研究最广泛、最有效的整合素配体。一旦RGD序列被整合素受体识别并相结合,就启动了整合素介导的细胞粘附过程,同时激活细胞与RGD之间的信号转导途径,由此影响细胞在材料上的生物学行为,如增殖、分化、迁移、存活或者凋亡。本研究即探索在PDLLA骨支架材料表面接枝含RGD的生物活性短肽的简便、有效的方法,并观察这种活性修饰PDLLA骨支架在体内、外的成骨作用。利用氨等离子体改性技术赋予PDLLA表面活性-NH2,并进一步与甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser, GRGDS)短肽溶液缩合反应,达到材料表面以酰胺键接枝生物活性短肽的目的,使PDLLA获得稳定的生物活性,也克服了氨改性后材料表面活性基团易于消逝的问题。目的1.探讨运用氨等离子体改性技术,在PDLLA骨支架表面以酰胺键锚定GRGDS短肽的可行性。2.建立SD大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)体外分离、培养和鉴定的方法；培养和鉴定SD大鼠慢病毒转染红色荧光蛋白(Red fluorescent protein, RFP)的BMSCs (RFP-BMSCs)。3.探讨氨等离子体锚定GRGDS短肽的PDLLA骨支架上RFP-BMSCs的贴附、增殖、代谢与矿化,以及该活性修饰材料与BMSCs构建的组织工程骨的体外成骨能力。4.建立SD大鼠股骨干8mm骨缺损模型,探讨新型活性修饰PDLLA组织工程骨对该动物模型的骨修复重建能力。方法1.氨等离子体锚定GRGDS短肽PDLLA骨支架的制备与检测(1) PDLLA骨支架的制备参考本课题组的“模压增强法”专利技术,改良部分方法制备PDLLA三维支架。成品为直径8 mm、高10mm的圆柱状PDLLA三维骨支架。均匀切成厚约1mm的圆片,备用。(2)表面氨基化PDLLA (Aminated PDLLA, A/PDLLA)的制备及检测将圆片状PDLLA三维支架材料置于等离子体处理仪的反应室内,抽真空至10 Pa左右,充入氨气至反应室气体压力恒定为30 Pa。调节放电功率至50 W、频率13.56 MHz,分别进行2、5、10、20和30 min的等离子体改性处理。分别取经过改性的实验组A/PDLLA和对照组PDLLA行表面形貌观察、孔径、孔隙率测定和表面接触角测量。(3)表面FITC-GRGDS接枝PDLLA (Peptides conjugated A/PDLLA, PA/PDLLA)的制备及检测将A/PDLLA骨支架材料浸入含EDC.HCl和NHS的1 mg/mL FITC-GRGDS多肽溶液中室温下低频振荡24 h,使材料表面的-NH2与FITC-GRGDS短肽S末端的-COOH缩合反应。X射线光电子能谱(XPS)分析材料改性前后、接枝肽处理后表面元素组成、元素比值变化和各元素化学态变化。激光共聚焦显微镜和高效液相色谱(HPLC)分别定性、定量检测FITC-GRGDS短肽的接枝情况。2.大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定(1)原代SD大鼠BMSCs的分离、培养与鉴定全骨髓贴壁法分离SD大鼠BMSCs,置于37℃、体积分数5% CO2的饱和湿度培养箱中培养。90%融合分瓶传代。倒置相差显微镜观察细胞形态和生长情况。MTT比色法绘制细胞生长曲线。传至P3的BMSCs,流式细胞术检测BMSCs表面标志物CD29、CD34、CD44和CD45的表达；成骨诱导培养21d后行碱性磷酸酶染色和茜素红染色。(2)SD大鼠P3 RFP-BMSCs的培养与鉴定复苏SD大鼠P3 RFP-BMSCs,37℃、体积分数5% CO2的饱和湿度培养箱培养。90%融合分瓶传代。倒置相差荧光显微镜观察细胞形态和生长情况。MTT比色法绘制细胞生长曲线。传至P4的细胞,成骨诱导培养21d后行碱性磷酸酶染色和茜素红染色；成脂诱导液培养至脂滴出现较多、较大时进行油红O染色。3. GRGDS修饰的PDLLA骨支架与种子细胞的体外构建(1)实验分组制备20 min氨改性A/PDLLA支架(A组)和20 min氨改性后接枝肽PA/PDLLA支架(PA组),以未经处理的PDLLA支架(P组)作为对照。所有骨支架材料切成直径8mm、厚1mm的圆片状,备用。(2)与RFP-BMSCs的构建及检测各组材料接种成骨诱导后的RFP-BMSCs。接种细胞后：①继续成骨诱导培养Id、2d、4d、6d、8d、10d、12d, CyQuant NF和AlamarBlue分别检测支架上细胞的增殖和代谢活性；②继续成骨诱导培养7d、14d、21d,倒置相差荧光显微镜观察细胞在材料上的增殖和贴附,钙黄绿素矿化荧光染色观察各组材料的体外成骨能力。(3)与BMSCs的构建及检测各组材料接种成骨诱导后的BMSCs,分别培养3d、7d、14d,进行实时荧光定量PCR检测骨钙素(Osteocalcin, OCN)、Ⅰ型胶原(Collgen-Ⅰ, Col-Ⅰ)、ALP、骨形态发生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2, Bmp-2)和骨桥蛋白(Osteopontin, OPN) mRNA的表达变化；分别培养7d、14d、21d,进行ALP活性测定；接种未经成骨诱导的BMSCs,分别培养4d、8d,进行扫描电镜观察。4. GRGDS修饰的PDLLA骨支架修复大鼠股骨干骨缺损(1)实验分组体重350～500g的成年雄性SD大鼠45只,随机分为3组,每组15只。以植入PA/PDLLA骨支架/BMSCs为实验组(PA/PDLLA组),PDLLA骨支架/BMSCs为对照组(PDLLA组),不植入材料和细胞的为空白对照组。术后饲养4、8、12周,每个时间点,每组各处死5只动物取材。(2)SD大鼠股骨干骨缺损模型的建立细胞悬液以多点注射的方法接种于柱状支架材料,调整细胞悬液密度至2.0×107～3.0×107个细胞/mL,每个支架接种100μL。手术过程：动物麻醉后,备皮、消毒、铺巾,沿股骨干长轴方向切开皮肤,逐层分离至股骨干,显露近、远侧干骺端。钻孔,放置内固定钢板于股骨干外侧,近、远端各拧上两枚螺钉。取下钢板、螺钉,轮锯截断股骨干,形成约8mm骨缺损模型。不锈钢板、螺钉固定股骨干骨缺损部位,不锈钢丝加强内固定。接种细胞的柱状支架放置于骨缺损部位。(3)取材及观察指标分别于相应时间点处死动物,取材行大体观察、X线检查、组织学检查和实时荧光定量PCR检测。结果1.制备的骨支架及检测结果(1)扫描电镜观察示支架材料内部呈三维多孔且孔隙间互相连通的结构,各组所见无明显差异。孔径、孔隙率各组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。氨改性时间延长,表面水接触角逐步下降。各组间两两比较差异均有统计学意义,除20 min和30 min组之间P=0.088外,其余各组两两之间P<0.001。(2)氨改性处理的PDLLA支架出现N1s峰。改性时间延长,N1s峰渐趋明显,20 min改性组达峰值。各处理时间的材料行肽接枝处理后,N元素比值相应加大,并出现S2p峰。未经处理的材料表面C峰可拟合为4个峰,经过氨改性及接枝肽处理,在285.7和288.3 eV结合能位置可得到两个新的拟合峰,分别归属为-C-NH-(氨基)和-C=O-NH-(酰胺基)。氨改性后材料表面存在以氨基为主的含氮基团。接枝肽处理后,材料表面氨基含量下降,酰胺基含量上升。(3)荧光共聚焦显微镜观察空白对照组材料表面仅见极微弱绿色荧光。接枝肽各组材料表面荧光强度随着氨改性时间的延长而明显增强,20 min改性组最强。空白对照组及接枝肽处理0、2、5 min组材料上的肽未被HPLC检出；接枝肽处理10、20和30 min组可被检出。接枝肽处理20 min组的肽量最多,30 min组次之,10 min组最少(F=71.578,P<0.01)。三组之间两两比较差异均有统计学意义(P<0.01)。2.大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定(1)SD大鼠BMSCs、RFP-BMSCs在普通光镜下观察多为长梭形或有2～3个突起；RFP-BMSCs在荧光镜下观察,细胞可激发出红色荧光。BMSCs和RFP-BMSCs生长曲线均呈S形。(2) BMSCs流式细胞仪表型鉴定示CD34、CD45双阴性,CD29、CD44双阳性；BMSCs、RFP-BMSCs的ALP染色、茜素红染色均呈阳性；RFP-BMSCs油红O染色阳性。3. GRGDS修饰的PDLLA骨支架与种子细胞的体外构建(1)接种RFP-BMSCs后各时间点,三组材料上细胞均能增殖,组间细胞数量差别均有统计学意义(P<0.001),PA组>A组>P组。除第10天(P=0.077)和第12天(P=0.491),PA组和A组间细胞数量差异无统计学意义外,其余各时间点,PA组数量均明显高于A组。随着时间的延长,两组间细胞数量逐渐接近。细胞代谢活性检测与增殖检测结果近似,骨支架上细胞增殖程度越高,其代谢越活跃。荧光显微镜观察,A组和PA组材料上RFP-BMSCs较P组增殖活跃；钙盐沉积荧光染色显示,第14天和第21天,绿色荧光强度PA组>A组>P组。(2)实时荧光定量PCR结果示：接种BMSCs后第3天,PA组各基因表达倍数均较P组高；除OCN外的各基因表达也均较A组高。第7天,A组OCN(13.13±1.28)、Co1-I(23.71±6.51)和OPN (27.4±7.17) mRNA表达倍数为最高,PA组次之。第14天,多数基因表达上调,A组和PA组表达倍数较对照组明显增高。PA组OCN(51.54±7.09)、ALP(24.26±3.41)和BMP-2(11.82±2.38) mRNA的表达较A组高,差异有统计学意义(P<0.05)。ALP活性检测结果示：A组和PA组ALP活性持续升高,P组活性第21天较第14天时略有下降。第7天,A组和PA组之间ALP活性比较无统计学意义(P>0.05),但均高于P组(P<0.01)；第14天和第21天,三组间ALP活性两两比较均有统计学意义,ALP活性PA组>A组>P组。扫描电镜显示,PA组材料能获得较A组更好的细胞贴附,P组细胞较稀疏。4. GRGDS修饰的PDLLA骨支架修复大鼠股骨干骨缺损(1) PA/PDLLA组术后4W,骨断端、材料内部已可见少量的新生软骨,有类骨样组织出现。术后8W,新生骨增多,出现成熟的骨细胞和编织骨。术后12W,新生骨逐渐改建,骨断端与材料之间以大量的编织骨或成熟的板层骨连接,界限不清。X线检查结果证实,PA/PDLLA组在术后4W即见到絮状高密度骨痂影,各时间点骨重建的影像学表现,PA/PDLLA组均优于PDLLA组。术后12W,PA/PDLLA组大量骨痂连接骨断端与材料,密度均匀、致密,骨折线模糊。(2)术后12W,空白对照组、PDLLA组和PA/PDLLA组三组间OCN、Col-Ⅰ、ALP、BMP2和OPN的表达倍数差异均有显著的统计学意义(P均<0.001)。PDLLA组和PA/PDLLA组各基因表达倍数的95%可信区间(CI)均不包含1。各基因表达均以PA/PDLLA组为最高,PDLLA组次之,空白对照组最低。结论1.氨等离子体改性氨等离子体改性能明显促进PDLLA表面以酰胺键接枝FITC-GRGDS活性短肽。2.全骨髓贴壁法能有效分离和扩增SD大鼠BMSCs。BMSCs符合干细胞表型特征,具有定向成骨诱导分化能力；RFP-BMSCs具有成骨、成脂诱导分化的能力。两者均可用作骨组织工程的种子细胞。3.氨等离子体锚定GRGDS肽的活性修饰PDLLA骨支架,能明显促进RFP-BMSCs为种子细胞的贴附、增殖、代谢与矿化。单纯氨等离子体改性能够促进骨支架上BMSCs早期向成骨细胞分化,而活性修饰PDLLA具有更好的促BMSCs体外成骨能力。4.氨等离子体锚定GRGDS肽的活性修饰PDLLA骨支架,能够通过上调成骨相关基因的表达来加速SD大鼠股骨干骨缺损模型的骨修复重建过程。