【摘 要】
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目的:肝硬化患者容易并发细菌感染,中性粒细胞免疫功能障碍在其中起关键作用。既往研究显示肝硬化患者中性粒细胞功能障碍可能与内毒素、人类非巯基白蛋白1(humannonmercaptalbumin1,HNA1)、多种炎性细胞因子水平升高等因素相关,但尚不知具体损伤原因及机制。肝硬化患者体内普遍存在内质网应激(endoplasmicreticulumstress,ERS)
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目的:肝硬化患者容易并发细菌感染,中性粒细胞免疫功能障碍在其中起关键作用。既往研究显示肝硬化患者中性粒细胞功能障碍可能与内毒素、人类非巯基白蛋白1(humannonmercaptalbumin1,HNA1)、多种炎性细胞因子水平升高等因素相关,但尚不知具体损伤原因及机制。肝硬化患者体内普遍存在内质网应激(endoplasmicreticulumstress,ERS)这一病理现象,且ERS可被内毒素、炎性细胞因子等多种因素所诱导,因此我们假设在肝硬化患者中,ERS是多种因素损伤中性粒细胞功能的共同机制,探索肝硬化患者中性粒细胞功能损伤与ERS之间的相关性。方法:采集肝硬化患者及健康人群外周静脉血,使用多形核细胞分离液分离得到中性粒细胞后,以台盼蓝染色及瑞氏-吉姆萨复合染色鉴定其活性及纯度。新收入院的肝硬化患者按Child-Pugh评分标准以及慢加急性肝衰竭(acute-on-chronicliverfailure,ACLF)诊断标准进行分组,分为肝硬化代偿期、失代偿期、慢加急性肝衰竭(有肝硬化基础疾病)3组,以健康人群作对照组,采集血液后分离中性粒细胞,采用蛋白免疫印迹法(westernblot,WB)检测ERS相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulatedprotein78,GRP78)、活化转录因子4(activatingtranscriptionfactor4,ATF4)、活化转录因子6α(activatingtranscriptionfactor6α,ATF6α)、C/EBP同源蛋白(C/EBPhomologousprotein,CHOP)的表达;采用RT-PCR检测ERS相关mRNAGRP78、需肌醇酶1(inositol-requiringenzyme1,IRE1)、ATF6、蛋白质激酶R样ER激酶(proteinkinaseR-likeERkinase,PERK)的表达;采用琼脂糖凝胶平板法检测中性粒细胞的趋化功能;采用流式细胞术检测中性粒细胞的呼吸爆发功能(即中性粒细胞产生活性氧的能力)。同样按上述分组采集血液,离心后收集血浆,使用酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)的方法检测血浆肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、内毒素水平。采集失代偿期肝硬化患者外周血进行体外实验,分离得到的中性粒细胞分别与正常培养基、失代偿期肝硬化患者血浆、添加4-苯基丁酸(4-phenylbutyricacid,4-PBA)的正常培养基(4-PBA为ERS抑制剂)、添加4-PBA的失代偿期肝硬化患者血浆培养3、6、9、12h,使用WB检测各时间点及各组中性粒细胞ERS相关蛋白GRP78、ATF6α、CHOP的表达,同样采用琼脂糖凝胶平板法检测体外干预后的中性粒细胞的趋化功能,采用流式细胞术检测中性粒细胞的呼吸爆发功能。结果:1.不同程度肝硬化患者外周血中性粒细胞GRP78、ATF4、ATF6α、CHOP蛋白的水平均较正常对照组显著升高(P
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