论文部分内容阅读
人肿瘤坏死因子(hTNFα)因其能在体内、外能特异杀伤肿瘤组织细胞而被认为是一种很有潜力的抗癌药物，然而它的毒副作用大大地限制了它在临床中的应用。为了降低hTNFα的毒副作用，保持和增加抗肿瘤活性，我们对hTNFα编码区基因进行改造，从而进一步研究hTNFα突变体结构和功能的关系。 hTNFα对大多数肿瘤细胞的杀伤作用，是通过与肿瘤细胞膜上特异性受体结合后，触发细胞内信号转导而使靶细胞产生凋亡效应。根据对hTNFα结构及功能关系研究的深入了解，利用PCR介导的定点突变删除hTNFαN端8个氨基酸，同时在30、42位氨基酸进行突变，获得了4个突变体，m1是单独缺失N端8个氨基酸；其它突变体是在m1的基础上叠加突变，即m2是Asn30Asp，m3是Asn30His，m4是Glu42Gly，这些突变体在大肠肝菌中得到了高效表达，其中m4以包涵体蛋白形式存在，其余以可溶性蛋白存在。分别对各突变体蛋白进行了纯化，之后从不同角度分析其特性。利用其能与相应抗体特异结合的性质进行Western Blot检测及免疫沉淀实验，定性、定量地检测hTNFα一级结构改造后其三维构象的变化对hTNFα基本构型和对抗原决定簇空间构象的影响。Western Blot检测结果发现各个突变体均能与抗野型hTNFα多克隆抗体发生特异性结合，说明各突变体仍以hTNFα的基本构型发挥其功能；等量的放射性标记的各突变体蛋白与等量抗野型hTNFα单克隆抗体结合后，产生了有差异的放射自显影条带，说明各突变体与单克隆抗体结合的抗原决定簇空间构象发生了一定的变化。分析各突变体的构象变化与生物学功能活性之间的关系，首选指标就是体内、外抗肿瘤活性及毒性的测定。从此测定可知，m2、m3突变体与野型hTNFα相比，比活性升高达10~3数量级，体内引起的肿瘤组织出血坏死较重(P＜0.01)，毒性分别为野型的2倍和1.7倍，比活性与毒性之间的比例相差很大，表明构建的m2、m3两个突变体抗肿瘤活性的增加，并未同比例的使其毒性增强，即这两个突变体对肿瘤组织细胞杀伤作用的增强是相当特异的。