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研究背景和目的肿瘤转移是一个多因素,多步骤的生物化学过程,转移表型的获得与多种转移效应基因的表达改变密切相关,因此,寻找新的转移效应基因对于深入研究肿瘤转移的分子生物学机制,及寻找新的治疗靶点都意义重大。目前,各种差异基因筛选技术在寻找转移效应基因中运用广泛,其中,抑制性消减杂交是Diatchenko等1996年提出的一种较成熟的筛选差异表达基因技术,具有操作简便、灵敏度高、假阳性率低、可有效分离低丰度差异表达基因等优点。但是,在通过SSH获得较为全面的差异产物的同时,仍然有少数表达相似的基因未被消减而保留下来,且SSH只能筛选出表达差异基因,却不能量化其表达差异,这些都给后期的分析工作造成一定困难。基因芯片能够同时检测大量基因的表达,将其用于消减文库的分析能够简化文库的后期分析工作。本实验中,我们将前期建立的前列腺癌细胞株PC3M-1E8和PC3M-2B4的消减杂交文库序列制作成基因芯片,与PC3M-1E8和PC3M-2B4的cDNA进行杂交,从中进一步筛选出表达差异较大的基因,测序及功能验证。从中选出annexinII初步研究了其与前列腺癌转移的关系。还对前期在卵巢癌基因芯片中发现的CXCL14的功能及机制进行了探讨。方法1.将前期建立的前列腺癌细胞株PC3M-1E8和PC3M-2B4消减杂交文库制备成基因芯片,与PC3M-1E8和PC3M-2B4的cDNA进行杂交,并对杂交信号进行分析。2.选取基因芯片中发现的表达差异显著的序列进行测序,并在GeneBank中进行同源性分析。3.利用RT-PCR验证annexinII在不同转移潜能的配对肿瘤细胞中的表达水平;实时定量PCR检测annexinII在临床前列腺癌标本中的表达水平,及与肿瘤转移的关系。4.基因工程技术构建CXCL14真核表达载体,转染SKOV3细胞,筛选出稳定表达CXCL14的克隆SKOV3/CXCL14。应用单层伤口愈合实验,CFSE,软琼脂克隆实验等方法研究外源性过表达CXCL14对SKOV3细胞增殖,迁移能力的影响。实验结果1.基因芯片验证共有56个序列在PC3M-1E8和PC3M-2B4中的表达差异大于两倍,测序及同源性分析其中包括17个已知基因及2条未知EST。2.annexinII在低转移肿瘤细胞株高表达,在高转移株中低表达,在前列腺癌中表达下调,且与Gleason评分具有相关性。4.成功构建了真核表达载体pcDNA3.1/CXCL14,筛选出稳定表达的克隆。单层伤口愈合实验,CFSE,软琼脂克隆实验证实外源性表达CXCL14的SKOV3细胞迁移及增殖能力均减弱。结论应用抑制性消减杂交技术成功构建了PC3M-1E8和PC3M-2B4的双向消减杂交文库,通过DNA芯片技术进一步验证文库中序列,选取部分表达差异较大的序列测序,在Genebank中同源性分析,发现17条已知基因及2条未知EST。从中选取了进行了进一步的研究。验证annexinII在不同转移潜能肿瘤细胞株及临床前列腺不同标本中表达,结果显示,annexinII的异常表达与肿瘤转移密切相关.探讨CXCL14的作用机制发现,在SKOV3中过表达CXCL14可以抑制其增殖及迁移能力。