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研究背景：急性淋巴细胞细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)是儿童时期最常见的恶性疾病,占<15岁儿童恶性肿瘤的25%。近年来,儿童白血病的发病率呈上升趋势,我国10岁以下儿童白血病发病率为3/10万-4/10万。儿童ALL中,约85%为B系淋巴细胞白血病(B lineage acute lymphoblastic leukemia, B-ALL),剩余15%为T系淋巴细胞白血病。尽管联合化疗方案和治疗策略的改善使得ALL患儿的生存率明显提高,但是仍有20%-30%的患儿不能完全缓解或复发而导致死亡,因此我们需要进一步探寻ALL的发病机制。B-ALL是以未成熟B淋巴细胞克隆性扩增为特点的恶性肿瘤,多种转录调控因子在这一进程中发挥了关键作用,尤其是调控淋巴细胞发育和成熟等基因的异常表达,可能在B-ALL发病过程中扮演了重要角色。含有锌指结构的IKAROS蛋白家族就是其中一类重要的调控因子,作为第二个被发现的IKAROS家族成员,转录因子AIOLOS在B淋巴细胞分化、增殖及成熟过程中发挥着至关重要的调控作用。研究发现,AIOLOS表达缺失会导致前B细胞和未成熟B细胞增多,而成熟的B细胞显著减少。而且,Aiolos缺失突变小鼠的B细胞处于高增殖状态,血清内抗体水平升高,进而促进自身抗体和淋巴瘤的发生,说明AIOLOS具有肿瘤抑制作用。临床研究证明AIOLOS的异常表达与成人B-ALL、慢性淋巴细胞白血病有关,在某些淋巴瘤病例中也发现了AIOLOS的异常表达。然而,AIOLOS在儿童B-ALL中的作用尚不明确,而且AIOLOS对白血病细胞发挥作用的机制也有待进一步研究。目的：1.检测AIOLOS在儿童B-ALL中的表达,初步了解AIOLOS在ALL发生发展中的作用。2.构建AIOLOS的慢病毒过表达载体并转染Nalm-6细胞,为研究AIOLOS在ALL中的作用建立基础。3.研究AIOLOS过表达对白血病细胞生物学行为的影响。4.阐明AIOLOS影响白血病细胞生物学行为的作用机制。方法：1. AIOLOS在B-ALL儿童骨髓白血病细胞及白血病细胞系中表达水平的检测1.1收集36例B-ALL患儿及6例健康志愿者的骨髓标本,密度梯度离心法分离单个核细胞,免疫磁珠分选CD19+的B淋巴细胞,采用RT-PCR及实时荧光定量PCR方法检测AIOLOS mRNA的表达水平。1.2以白血病细胞系Ball-1、Nalm-6、Jurkat、Molt-4和K562为研究对象,以健康儿童B淋巴细胞为对照,采用实时荧光定量PCR及Western blotting法分别检测AIOLOS在mRNA和蛋白水平的表达。2. AIOLOS慢病毒过表达载体的构建及表达鉴定2.1通过RT-PCR方法从健康人外周血单个核细胞中获得AIOLOS基因全长,经EcoR Ⅰ和Mlu Ⅰ双酶切后,将AIOLOS基因片段与慢病毒表达载体pWPT-PURO-GFP连接重组为pWPT-PURO-AIOLOS。通过4质粒系统共转染293T细胞进行病毒包装,并以稀释滴定法测定病毒滴度。2.2慢病毒感染B-ALL细胞系Nalm-6后,采用流式细胞术、实时荧光定量PCR及Western blotting法检测AIOLOS细胞中的表达。ENalm-6过表达对3. AIOLOS细胞生物学行为的影响Nalm-63.1将细胞分为三组：实验组,即Nalm-6过表达载体转染组,称为AIOLOS阴性对照组,即空载体转染组,称为Nalm-6-AIOLOS;空白Nalm-6-Mock;对照组,即未经转染的细胞,称为Nalm-63.2细胞增殖：采用CCK-8法检测转染后Nalm-6-Control。细胞的吸光度值,并绘制7-11 d Nalm-6增殖曲线。3.3细胞周期分布：利用碘化丙啶(PI)染色后,以流式细胞术检测细胞Nalm-6的细胞周期分布。3.4细胞凋亡：采用Annexin V与PI双染法,以流式细胞仪检测各组细胞凋亡。3.5细胞对化疗药物敏感性检测：经不同浓度的长春新碱(VCR)或柔红霉素(DNR)作用24h后,以CCK-8法检测三组细胞的吸光度值,并计算各化疗药物的IC50值。3.6细胞侵袭能力：以Transwell细胞迁移实验检测Nalm-6细胞的侵袭能力；Nalm-6细胞与骨髓基质细胞HS-5共培养48 h后,应用Matrigel管状形成实验检测HS-5细胞的体外血管新生能力。4. AIOLOS过表达影响Nalm-6细胞生物学行为的机制研究4.1细胞周期与凋亡相关基因和蛋白的检测：以实时荧光定量PCR法检测三组细胞中BCL-2、BAX、P27、CyclinD3、C-MYC基因的表达；以Western blotting法检测三组细胞中BCL-2、P27、CyclinD3蛋白的表达。4.2血管生成相关基因的检测：以实时荧光定量PCR法检测三组细胞中VEGF、 PLGF和ANG1基因的表达;4.3微阵列芯片检测及基因芯片数据分析：应用人类全基因组芯片,筛选Nalm-6-AIOLOS细胞与Nalm-6-Mock细胞之间的差异表达基因；并基于DAVID数据库对差异表达基因进行GO聚类和KEGG通路分析。4.4 PI3K/Akt信号通路：使用FlowCellect PI3K/MAPK Dual Pathway Activation Detection Kit,以流式细胞术检测三组细胞PI3K/Akt信号通路的活化情况。4.5 Akt抑制剂对Nalm-6-AIOLOS细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响：实验分为Nalm-6-AIOLOS、Nalm-6-Mock、Nalm-6-Control及Nalm-6-AIOLOS+Akt抑制剂四组,以Western blotting法检测四组细胞中Akt、磷酸化Akt (pAkt)蛋白的表达量；细胞计数法检测四组细胞增殖,并绘制生长曲线；利用PI染色后,流式细胞术检测各组细胞的细胞周期分布；采用Annexin V与PI双染法,以流式细胞术检测各组细胞凋亡。结果：1. AIOLOS在B-ALL儿童骨髓白血病细胞及白血病细胞系中的表达水平1.1正常儿童B淋巴细胞中AIOLOS基因主要有三种亚型,分别为AIO1、AlO2和AIO5。B-ALL患儿中AIOLOS基因的亚型分布与正常组无明显差别。所有标本中,A101亚型的表达频率最高。B-ALL患儿组AIOLOS基因的表达水平较健康儿童低,差异具有统计学意义(P<0.05),但AIOLOS的表达水平与患儿性别、免疫分型和危险度分组无明显关联(P>0.05)。1.2 B-ALL细胞系Nalm-6中AIOLOS mRNA的表达水平较正常B淋巴细胞低,差异具有统计学意义(P<0.05),相应地,Nalm-6细胞中AIOLOS蛋白表达水平也较正常组低(P<0.05)。2. AIOLOS慢病毒过表达载体的构建及表达鉴定成功构建了pWPT-PURO-AIOLOS’慢病毒表达载体,测序鉴定结果与AIOLOS基因序列一致。在293T细胞中进行病毒包装获得的病毒滴度为3.23×108TU/ml,满足实验要求。当感染复数(MOI)为100时,Nalm-6细胞感染率可达90%以上。转染后的Nalm-6细胞,AIOLOS在mRNA和蛋白水平表达均明显上调(P<0.05)。3. AIOLOS过表达对Nalm-6细胞生物学行为的影响3.1细胞增殖实验显示Nalm-6-AIOLOS细胞的增殖速度明显慢于Nalm-6-Control和Nalm-6-Mock (P<0.05)。3.2与Nalm-6-Control细胞相比,AIOLOS过表达后,Nalm-6细胞在G0/G1期的比例由70.4%±2.39%升至84.1%±2.18%,差异具有统计学意义(P<0.05),而处于S期和G2/M期的细胞则分别由20.3%±0.94%和7.3%±0.81%(Nalm-6-Control)降至11.7%±0.78%和2.2%±0.56%(Nalm-6-AIOLOS),差异均有统计学意义(P<0.05)= Nalm-6-Control与Nalm-6-Mock在各细胞周期的比例无明显差异(P>0.05)。3.3 Nalm-6-AIOLOS、Nalm-6-Mock与Nalm-6-Control总凋亡细胞比例分别为10.55%±0.67%,16.87%±0.52%,18.13%±0.51%, Nalm-6-AIOLOS组细胞凋亡较另外两组细胞凋亡明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)；其中,与Nalm-6-Control细胞(7.86%±0.52%)相比,Nalm-6-AIOLOS细胞的晚期凋亡比例(2.83%±0.67%)明显减少(P<0.05)。3.4三组细胞对VCR或DNR的敏感性无明显差异。相比于Nalm-6-Control, Nalm-6-AIOLOS细胞对VCR和DNR 24 h的IC50值分别为19.91 ng/ml (vs. 18.44 ng/ml)和3.62 ng/ml (vs.3.22 ng/ml),差异均无统计学意义(P>0.05)。3.5 Tranwell细胞迁移实验中,Nalm-6-AIOLOS与Nalm-6-Control在450nm波长处的吸光度值分别为0.11±0.05和0.14±0.06,差异无统计学意义(P>0.05)。体外血管新生实验发现,与Nalm-6-AIOLOS共培养后,HS-5细胞的网格状结构形成较另外两组增多。4. AIOLOS过表达影响Nalm-6细胞生物学行为的机制研究4.1与Nalm-6-Control目比,Nalm-6-AIOLOS细胞中BCL-2基因表达明显上调(P<0.05), BAX和CyclinD3基因表达明显下调(P<0.05),而C-MYC和P27基因表达变化不大(P>0.05); BCL-2与P27蛋白在三组细胞中的表达量相差不大(P>0.05),CyclinD3蛋白在Nalm-6-AIOLOS细胞中的表达量明显低于在另外两组细胞中的表达量(P<0.05)。4.2与Nalm-6-Control组细胞相比,Nalm-6-AIOLOS组细胞的VEGF、PLGF和ANG1基因表达均上调了2倍以上(P<0.05)。4.3基因芯片共筛选出差异表达基因278个,其中,Nalm-6-AIOLOS组细胞表达上调基因102个,表达下调基因176个;差异表达基因涉及的GO分类主要有生物学调控、代谢过程、信号转导、结合、信号转导活性等；差异表达基因涉及的KEGG通路主要有Pancreatic secretion、Neuroactive ligand-receptor interaction、 Small cell lung cancer、Melanoma等 。4.4流式细胞术结果显示Nalm-6-AIOLOS中pAkt阳性细胞比例较Nalm-6-Mock与Nalm-6-Control组细胞明显增多(P<0.05)。Western blotting结果显示,Akt蛋白在三组细胞中的表达并无明显差异,然而,Nalm-6-AIOLOS组细胞pAkt蛋白却明显高于另外两组(P<0.05)。另外,给予Akt抑制剂处理后,Nalm-6-AIOLOS组细胞Akt蛋白的表达无明显改变,但pAkt蛋白明显下调(P<0.05)。4.5 Akt抑制剂可有效增加Nalm-6-AIOLOS田胞的凋亡比例,但对Nalm-6-AIOLOS细胞的增殖和细胞周期分布无明显影响。结论：1. B-ALL儿童白血病细胞中AIOLOS基因的表达水平减低;2. AIOLOS过表达抑制了Nalm-6细胞的增殖,将细胞周期阻滞在G0/G1期,同时抑制细胞凋亡；3. AIOLOS过表达主要通过CyclinD3依赖性的信号通路抑制Nalm-6细胞的增殖与细胞周期,而通过PI3K/Akt信号通路的活化促进细胞存活。