论文部分内容阅读
戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)属于戊型肝炎病毒科（Hepevirdae）正戊肝病毒属（Orthohepevirus），是单股、正链、无包膜的RNA病毒。戊型肝炎病毒粒子为正二十面体，直径约为27-35nm，基因组全长约为7.2kb，通常包括三个部分重叠的开放阅读框(Open reading frames，ORFs)，分别为与病毒RNA复制有关的ORF1、编码病毒衣壳蛋白的ORF2和与病毒复制和组装有关的ORF3。由HEV引起的人戊型肝炎(HE)在亚洲、非洲、美洲、欧洲等地区均有暴发流行。除此之外，HEV及其类似病毒已经在野猪、家养猪、雪貂、水貂、狐狸、兔、蝙蝠、鼠、狐狸、禽等多种动物中检测到，说明这类病毒能够在多种动物宿主中传播。2014-2015年，我们对云南省的啮齿动物肝炎病毒流行情况进行调查，发现该地区啮齿动物携带与HEV相似的病毒，并在丽江高山姬鼠(Apodemuschevrieri)和泸西县黑腹绒鼠（Eothenomys melanogaster）体内发现两类新型HEV，分别命名为丽江戊肝病毒(LiJiang hepatitis E virus，LJ-HEV)和泸西戊肝病毒（Luxi hepatitisE virus，LX-HEV）。本研究对云南地区HEV流行情况及对LJ-HEV和LX-HEV进行了遗传进化等方面进行研究，主要结果如下: 我们对来自我国云南省的3科4属7种共计278份啮齿动物肝组织样品进行了RT-PCR检测，获得了67份HEV阳性样品，阳性率为24.1％，其中1份阳性样品来自中华绒鼠(Eothenomys chinensis)，6份阳性样品来自黑腹绒鼠(Eothenomys melanogaster)，其余60份阳性样品来自高山姬鼠(Apodemuschevrieri)。对RdRp部分序列(240bp)比对发现这些阳性序列之间的相似性为63-99％，存在较大遗传多样性;与已报道的病毒序列相似性为74-89％，可能存在新型戊型肝炎病毒。进一步分析显示，中华绒鼠HEV与雪貂HEV亲缘关系最近，核苷酸和氨基酸相似性分别为75％和81％;与黑腹绒鼠HEV和高山姬鼠HEV亲缘关系最近的均是鼠HEV，前者与鼠HEV核苷酸和氨基酸相似性分别为73-78％和67-71％，后者分别为74-89％和91-100％。 获得两类(LJ-HEV，LX-HEV)共计四条新型HEV全基因组序列:LJ-14、LJ-86、LX-40、LX-67，长度分别为6982bp、6980bp、6974bp、6977bp。该四株病毒具有戊肝病毒科的典型3个ORF(ORF1，ORF2，ORF3)，其中LJ14和J86还具鼠HEV特有的ORF4。比对发现LJ-HEV同源性最高的为鼠HEV LA-B350，相似性为65％，LX-HEV也与鼠HEV LA-B350序列同源性最高但相似性仅54-55％，表明LX-HEV与已知的HEV差异性更大，可能为新型HEV。针对HEV的不同ORF比对结果与全基因组比对分析结果一致，均显示了与目前已知HEV序列存在巨大差异。遗传距离(P-distance)结果显示，LJ-HEV属C型戊肝病毒，LX-HEV为新型戊肝病毒。 为了进一步开展动物中新型戊型肝炎病毒血清流行病学调查，我们选择LJ14编码衣壳蛋白的ORF2进行了原核表达，结果显示全长ORF2蛋白形成包涵体可溶性较低。去除疏水区后的ORF2截短蛋白为可溶性蛋白，本研究成功纯化了该截短蛋白，并免疫兔制备了效价约128，000的多克隆抗体，初步ELISA实验从73份鼠血清检测到9份阳性样本，抗体阳性率为12.3％。