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随着哺乳动物体外受精、细胞核移植和干细胞等胚胎工程技术的快速发展,对卵母细胞的需求日益增加,通过活体采卵（ovum pick up,OPU）和屠宰场收集卵巢可获得大量生发泡（germinal vesicle,GV）期卵母细胞,玻璃化冷冻后可以随用随取,有助于克服卵母细胞来源、时间和地域的限制,但GV期卵母细胞冷冻后发育能力极低,限制了其应用,因此,有必要对GV期卵母细胞冷冻机理进行深入探索。卵母细胞玻璃化冷冻保存成功率主要受冷冻温度（vitrification temperatures,VTs）、冷冻保护剂浓度（cryoprotective agent concentrations,CPAs）和冷冻载体体积三个因素影响。一定CPAs范围内,VTs越低、CPAs越高、载体体积越小,玻璃化冷冻效果越好。经过世界范围内大量科学家反复探索,冷冻载体体积已降至极致,以目前的技术手段无法通过继续减小冷冻载体体积来提高冷冻效果,因此,目前提高玻璃化冷冻效果的焦点主要集中在VTs和CPAs上。本实验室前期研究发现,不同VTs和CPAs对牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻-解冻后m RNA表达水平产生明显影响,进而影响卵母细胞的发育能力,但是不同VTs和CPAs对牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻后长链非编码RNA（long non-coding RNAs,lncRNA）表达的影响尚未见报道。因此,本研究选取牛GV期卵母细胞进行玻璃化冷冻,探讨不同VTs（-269℃vs.-196℃）和CPAs（5.6M vs.6.6 M）对卵母细胞后续发育能力和lncRNA表达的影响,并分析lncRNA表达量变化对玻璃化冷冻后卵母细胞发育能力的影响,为改进牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻方法提供新视角。试验1:不同VTs和CPAs对牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻后发育能力的影响。将收集的牛卵丘卵母细胞复合体（cumulus oocyte complexes,COCs）随机分为五组:新鲜组（对照组）、LHe 5.6 M组（液氦,-269℃;17.5%DMSO+17.5%EG+0.5 M蔗糖）、LHe 6.6 M组（-269℃;20%DMSO+20%EG+0.5M蔗糖）、LN 5.6 M组（液氮,-196℃;17.5%DMSO+17.5%EG+0.5 M蔗糖）、LN 6.6 M组（-196℃;20%DMSO+20%EG+0.5 M蔗糖）。其中新鲜组COCs直接进行体外成熟（in vitro maturation,IVM）、体外受精（in vitro fertilization,IVF）和胚胎体外培养（in vitro culture,IVC）,而4个玻璃化组COCs经不同VTs和CPAs进行玻璃化冷冻-解冻后进行IVM、IVF和IVC,然后统计分析各组的形态正常率、成熟率、卵裂率和囊胚率。在4个玻璃化组中,LHe 5.6 M组囊胚率最高（13.22%）,其次是LHe 6.6 M组（10.19%）和LN 6.6M组（9.77%）,而LN 5.6 M组最低（1.87%）。结果表明,不同VTs和CPAs对牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻后发育能力有显著影响。试验2:不同VTs和CPAs对牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻后lncRNA表达的影响。试验分组同上,其中新鲜组COCs直接体外培养,其余4组COCs经不同VTs和CPAs进行玻璃化冷冻-解冻后再体外培养,培养至MII期时,各组挑选20枚优质卵母细胞进行转录组测序（RNA sequencing,RNA-seq）。结果共鉴定出18271个lncRNA。4个玻璃化组与新鲜组相比,有2158个差异表达lncRNA。将差异lncRNA的所有靶基因与本实验室前期筛选的GV期卵母细胞玻璃化冷冻后差异表达基因取交集,共得到14个差异表达靶基因,分别为ANGPT2、ARHGAP18、AURKA、DNAJC24、EEF1AKMT1、ERAP2、GINS4、GLA、HACD4、HMGB2、LEO1、N6AMT1、NCF2和POP4,它们对应于17个差异lncRNA。QRT-PCR结果表明,上述17个差异lncRNA的表达与测序结果表达趋势基本一致。将试验分组信息和lncRNA的表达趋势进行关联分析,发现6个lncRNA（MSTRG.12295.5、MSTRG.37123.1、MSTRG.37930.2、MSTRG.40464.9、MSTRG.8869.3和MSTRG.26680.6）的表达改变可能与VTs变化有关,同时,在LHe玻璃化冷冻时,它们的表达可能还与CPAs有关;MSTRG.35129.6的表达可能与VTs和CPAs的变化均有关;10个lncRNA（MSTRG.3578.3、MSTRG.40576.3、MSTRG.6723.5、MSTRG.32862.4、MSTRG.1184.4、MSTRG.33110.3、MSTRG.40454.2、MSTRG.41073.2、MSTRG.44732.4和MSTRG.6729.3）的表达可能与玻璃化冷冻有关。共表达分析表明,MSTRG.12295.5、MSTRG.37930.2、MSTRG.40454.2、MSTRG.8869.3和MSTRG.6723.5有可能通过调控靶基因的表达改进玻璃化冷冻后卵母细胞的发育能力。结论:不同VTs和CPAs明显影响牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻后lncRNA表达量;lncRNA表达水平的改变与VTs、VTs-CPAs和玻璃化冷冻有关;lncRNA可通过靶基因调控一系列生物学过程而影响玻璃化冷冻后牛GV期卵母细胞的发育能力。