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【背景】
在我国，胃癌的发病率和致死率仅次于肺癌，位居第二位。尽管近年来对胃癌的筛查和治疗已经取得了较为显著的进步，但是胃癌患者的长期生存率仍然较低。多药耐药的出现严重削弱了化疗药物的疗效，是胃癌患者预后不良的主要原因之一。
作为一种重要的蛋白翻译后修饰，糖基化修饰对糖蛋白的折叠、稳定性、亚细胞定位以及生物学功能有着重要的调节作用。目前，异常的糖基化修饰已被普遍视作肿瘤的一个重要特征，与肿瘤的发生、进展、转移以及化疗耐药密切相关。我们之前的工作已经发现蛋白的糖基化修饰在胃癌细胞多药耐药过程中发生了显著的变化，并得到了一批多药耐药相关的糖蛋白，提示糖基化修饰的异常参与调节胃癌细胞的耐药表型。因此，本课题从多个角度出发来探究糖基化修饰对胃癌细胞多药耐药的具体作用，为彻底阐明胃癌多药耐药的分子机制提供新的、重要的补充。
【目的】
1.明确N-糖基化修饰抑制剂对胃癌细胞化疗敏感性的作用和机制。
2.明确胃癌细胞多药耐药过程中具体糖基化类型的变化及其对应的糖基化修饰酶，找到能够调节胃癌细胞耐药表型的关键糖基化修饰酶并揭示其背后的作用机制。
3.明确候选的多药耐药相关糖蛋白在胃癌细胞多药耐药中的具体作用和机制。
【方法】
1.通过细胞活性试验检测药物对细胞的毒性作用；通过流式细胞术检测细胞的凋亡；综合运用PCRarray，westernblot，细胞免疫荧光以及相关抑制剂来确定糖基化抑制剂选择性作用于胃癌耐药细胞的分子机制。
2.通过lectinarray确定胃癌细胞在多药耐药过程中具体糖基化类型的变化，随后参考文献和数据库得到与差异变化糖型相关的糖基化修饰酶；通过TMT标记定量蛋白组学技术检测胃癌细胞多药耐药过程中蛋白尤其是糖基化修饰酶的表达变化；综合分析lectinarray和蛋白组学检测得到的相应糖基化修饰酶，获得一批可能与胃癌多药耐药相关的糖基化修饰酶；通过慢病毒下调胃癌细胞中候选糖基化修饰酶的表达，利用高内涵技术筛选得到能够影响胃癌细胞耐药表型的关键糖基化修饰酶以待进一步研究。
3.通过慢病毒下调胃癌细胞中候选糖蛋白的表达，随后利用高内涵功能筛选技术来大规模地验证候选糖蛋白对胃癌细胞耐药表型的具体作用。
【结果】
1.N-糖基化抑制剂tunicamycin(Tu)对胃癌耐药细胞的抑制作用远高于亲本细胞，这可能与多药耐药细胞中较高的基础内质网应激水平相关；Tu可以通过进一步激活细胞的内质网应激，以时间/剂量依赖的方式特异性地诱导胃癌多药耐药细胞死亡；Tu可以增加化疗药物作用下胃癌细胞的死亡，逆转胃癌细胞的耐药表型；Tu对细胞中糖基化修饰的抑制效应决定了其对胃癌多药耐药细胞的高度选择性作用；抑制Tu诱导的细胞自噬可以增强Tu的化疗增敏作用。
2.Lectinarray实验结果表明胃癌细胞的多糖谱在多药耐药过程中发生了明显的变化，随后我们进一步确定了分别与SGC7901/ADR和SGC7901/VCR细胞中差异表达多糖相对应的103个以及144个糖基化修饰酶；TMT标记定量蛋白组学分析结果显示与亲本细胞相比，SGC7901/ADR中的1596个差异表达蛋白(844个上调蛋白，752个下调蛋白)有23个是糖基化修饰酶，SGC7901/VCR中的2210个差异表达蛋白(1180个上调蛋白，1030个下调蛋白)有32个是糖基化修饰酶；结合lectinarray实验中得到的与差异表达多糖相关的糖基化修饰酶，我们得到了多药耐药细胞中可能与多糖变化相对应的20个差异表达糖基化修饰酶；高内涵功能筛选实验结果显示对多个分子表达的下调都能够影响胃癌细胞的化疗敏感性，其中UGGT1的下调能够显著增加胃癌细胞对化疗药物的抵抗，FUCA2的下调则能够明显增加胃癌细胞的化疗敏感性。
3.高内涵功能筛选实验结果表明，与对照组相比，分别下调胃癌多药耐药细胞SGC7901/ADR中20个候选糖蛋白的表达无法显著改变胃癌细胞的增殖速率以及在药物作用下的细胞存活率，提示对胃癌细胞中20个耐药相关糖蛋白的单独调节可能并不足以显著影响胃癌细胞的增殖能力和化疗敏感性。
【结论】
本研究明确了胃癌细胞多药耐药过程中具体糖基化类型的改变以及相应糖基化修饰酶的表达变化，表明化疗耐药过程中细胞多糖谱的变化在很大程度上源于细胞内糖基化修饰酶表达的改变；同时，对一些关键糖基化修饰酶(UGGT1、FUCA2、GLB1、GUSB、MOGS和HEXB)的下调能够影响胃癌细胞的化疗敏感性。此外，N-糖基化抑制剂tunicamycin能够通过抑制糖基化修饰，加重胃癌多药耐药细胞中的内质网应激水平，促进化疗药物诱导的细胞死亡，逆转胃癌细胞的耐药表型。总之，我们的实验结果进一步证明了异常的糖基化修饰对胃癌多药耐药的重要调节作用，为胃癌多药耐药分子机制的阐明提供了新思路，有助于我们今后开发出能够预测和逆转胃癌化疗耐药的新的、更有效的方法。
在我国，胃癌的发病率和致死率仅次于肺癌，位居第二位。尽管近年来对胃癌的筛查和治疗已经取得了较为显著的进步，但是胃癌患者的长期生存率仍然较低。多药耐药的出现严重削弱了化疗药物的疗效，是胃癌患者预后不良的主要原因之一。
作为一种重要的蛋白翻译后修饰，糖基化修饰对糖蛋白的折叠、稳定性、亚细胞定位以及生物学功能有着重要的调节作用。目前，异常的糖基化修饰已被普遍视作肿瘤的一个重要特征，与肿瘤的发生、进展、转移以及化疗耐药密切相关。我们之前的工作已经发现蛋白的糖基化修饰在胃癌细胞多药耐药过程中发生了显著的变化，并得到了一批多药耐药相关的糖蛋白，提示糖基化修饰的异常参与调节胃癌细胞的耐药表型。因此，本课题从多个角度出发来探究糖基化修饰对胃癌细胞多药耐药的具体作用，为彻底阐明胃癌多药耐药的分子机制提供新的、重要的补充。
【目的】
1.明确N-糖基化修饰抑制剂对胃癌细胞化疗敏感性的作用和机制。
2.明确胃癌细胞多药耐药过程中具体糖基化类型的变化及其对应的糖基化修饰酶，找到能够调节胃癌细胞耐药表型的关键糖基化修饰酶并揭示其背后的作用机制。
3.明确候选的多药耐药相关糖蛋白在胃癌细胞多药耐药中的具体作用和机制。
【方法】
1.通过细胞活性试验检测药物对细胞的毒性作用；通过流式细胞术检测细胞的凋亡；综合运用PCRarray，westernblot，细胞免疫荧光以及相关抑制剂来确定糖基化抑制剂选择性作用于胃癌耐药细胞的分子机制。
2.通过lectinarray确定胃癌细胞在多药耐药过程中具体糖基化类型的变化，随后参考文献和数据库得到与差异变化糖型相关的糖基化修饰酶；通过TMT标记定量蛋白组学技术检测胃癌细胞多药耐药过程中蛋白尤其是糖基化修饰酶的表达变化；综合分析lectinarray和蛋白组学检测得到的相应糖基化修饰酶，获得一批可能与胃癌多药耐药相关的糖基化修饰酶；通过慢病毒下调胃癌细胞中候选糖基化修饰酶的表达，利用高内涵技术筛选得到能够影响胃癌细胞耐药表型的关键糖基化修饰酶以待进一步研究。
3.通过慢病毒下调胃癌细胞中候选糖蛋白的表达，随后利用高内涵功能筛选技术来大规模地验证候选糖蛋白对胃癌细胞耐药表型的具体作用。
【结果】
1.N-糖基化抑制剂tunicamycin(Tu)对胃癌耐药细胞的抑制作用远高于亲本细胞，这可能与多药耐药细胞中较高的基础内质网应激水平相关；Tu可以通过进一步激活细胞的内质网应激，以时间/剂量依赖的方式特异性地诱导胃癌多药耐药细胞死亡；Tu可以增加化疗药物作用下胃癌细胞的死亡，逆转胃癌细胞的耐药表型；Tu对细胞中糖基化修饰的抑制效应决定了其对胃癌多药耐药细胞的高度选择性作用；抑制Tu诱导的细胞自噬可以增强Tu的化疗增敏作用。
2.Lectinarray实验结果表明胃癌细胞的多糖谱在多药耐药过程中发生了明显的变化，随后我们进一步确定了分别与SGC7901/ADR和SGC7901/VCR细胞中差异表达多糖相对应的103个以及144个糖基化修饰酶；TMT标记定量蛋白组学分析结果显示与亲本细胞相比，SGC7901/ADR中的1596个差异表达蛋白(844个上调蛋白，752个下调蛋白)有23个是糖基化修饰酶，SGC7901/VCR中的2210个差异表达蛋白(1180个上调蛋白，1030个下调蛋白)有32个是糖基化修饰酶；结合lectinarray实验中得到的与差异表达多糖相关的糖基化修饰酶，我们得到了多药耐药细胞中可能与多糖变化相对应的20个差异表达糖基化修饰酶；高内涵功能筛选实验结果显示对多个分子表达的下调都能够影响胃癌细胞的化疗敏感性，其中UGGT1的下调能够显著增加胃癌细胞对化疗药物的抵抗，FUCA2的下调则能够明显增加胃癌细胞的化疗敏感性。
3.高内涵功能筛选实验结果表明，与对照组相比，分别下调胃癌多药耐药细胞SGC7901/ADR中20个候选糖蛋白的表达无法显著改变胃癌细胞的增殖速率以及在药物作用下的细胞存活率，提示对胃癌细胞中20个耐药相关糖蛋白的单独调节可能并不足以显著影响胃癌细胞的增殖能力和化疗敏感性。
【结论】
本研究明确了胃癌细胞多药耐药过程中具体糖基化类型的改变以及相应糖基化修饰酶的表达变化，表明化疗耐药过程中细胞多糖谱的变化在很大程度上源于细胞内糖基化修饰酶表达的改变；同时，对一些关键糖基化修饰酶(UGGT1、FUCA2、GLB1、GUSB、MOGS和HEXB)的下调能够影响胃癌细胞的化疗敏感性。此外，N-糖基化抑制剂tunicamycin能够通过抑制糖基化修饰，加重胃癌多药耐药细胞中的内质网应激水平，促进化疗药物诱导的细胞死亡，逆转胃癌细胞的耐药表型。总之，我们的实验结果进一步证明了异常的糖基化修饰对胃癌多药耐药的重要调节作用，为胃癌多药耐药分子机制的阐明提供了新思路，有助于我们今后开发出能够预测和逆转胃癌化疗耐药的新的、更有效的方法。