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目的:肾小球滤过膜受损是糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)的主要特征,然而近年来研究发现,肾小管间质损伤在DN发生发展中亦扮演重要作用。我们前期研究结果表明,炎症介导的胆固醇稳态失调能够促进DN足细胞损伤,然而炎症在肾小管上皮细胞胆固醇稳态失调中的作用如何,目前尚不清楚。此外,近年来研究发现,糖尿病(diabetes mellitus,DM)存在肠道菌群紊乱,但肠道菌群紊乱能否通过介导肾小管间质胆固醇稳态失调促进DN肾间质损伤,目前亦缺乏研究。因此,本研究分两部分,通过体内、体外研究分别观察了炎症、肠道菌群紊乱在介导肾小管间质胆固醇稳态失调,促进DN肾间质损伤中的作用,并进一步探讨了其潜在的作用机制。方法:第一部分,体内研究,给予db/db小鼠每隔一日0.5ml 10%酪蛋白背部皮下注射诱导DN微炎症模型(db/db+casein组),DM对照组给予等量的蒸馏水注射(db/db组)。体外研究,使用白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)刺激高糖培养的HK-2细胞,观察炎症因子刺激对细胞胆固醇稳态的影响,并采用siRNA基因沉默技术探讨CXC型趋化因子配体16(CXC motif chemokine ligand 16,CXCL16)信号通路在HK-2细胞胆固醇稳态失调中的作用。第二部分,体内研究包括两部分内容:其一,给予链脲左菌素诱导的Ⅰ型DM大鼠广谱抗生素溶液干预,以杀灭大鼠的肠道菌群,探究肠道菌群在DN肾间质胆固醇稳态失调及损伤中的作用。将大鼠分为三组,正常对照组(Control)、糖尿病组(DM)、糖尿病+抗生素干预组(DM+AB)。干预8周后,收集血、尿、粪便、肾组织标本,用于生化指标、肠道菌群分析、目标蛋白检测和组织病理学分析等;其二,收集正常大鼠粪便,提取粪菌,通过灌胃移植给DM大鼠,验证经纠正的的肠道菌群对DN肾间质胆固醇稳态失调及损伤的改善作用。将大鼠分为三组,正常对照组(Control)、糖尿病组(DM)、糖尿病+粪菌移植组(FMT)。粪菌移植成功后,继续饲养8周。体外研究,使用乙酸钠刺激高糖培养的HK-2细胞,观察乙酸对HK-2细胞胆固醇稳态的影响,检测G蛋白偶联受体43(G protein coupled receptor 43,GPR43)、胆固醇合成及摄取蛋白的表达情况,并应用siRNA基因沉默技术验证乙酸/GPR43信号通路对HK-2细胞胆固醇稳态的作用。临床生化法检测血糖、血脂、尿肌酐等指标。酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测尿白蛋白水平。过碘酸-雪夫(periodic acid-schiff,PAS)染色、透射电镜观察肾小管间质组织病理和超微结构改变。油红O染色、透射电镜、Filipin染色观察肾小管间质及细胞中脂质沉积情况。游离胆固醇定量试验检测肾组织及HK-2细胞中胆固醇水平。免疫组化、免疫荧光、实时定量PCR、Western Blotting检测肾组织及HK-2细胞中CXCL16信号通路分子、胆固醇稳态相关蛋白、胞外基质蛋白、GPR43的表达水平。气相色谱法检测大鼠血清中乙酸的水平。应用16S核糖体DNA测序分析肠道菌群丰度、多样性和结构。结果:第一部分,与db/db组相比,db/db+casein组小鼠尿液白蛋白肌酐比值(albumin creatinine ratio,ACR)和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-Dglucosaminidase,NAG)肌酐比值升高。酪蛋白注射加重db/db小鼠肾间质损伤,包括肾小管扩张、肾小管上皮细胞坏死增加、肾间质纤连蛋白(Fibronectin)和α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达增加。同时,db/db+casein组小鼠肾间质胆固醇沉积显著高于对照组,并且肾小管间质CXCL16信号通路分子的表达水平显著升高。体外研究中,IL-1β刺激显著增加了高糖背景下HK-2细胞中的胆固醇沉积,并加重细胞损伤,表现为活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)生成增加、Fibronectin和α-SMA表达增加。进一步地我们发现,IL-1β干预亦显著上调了CXCL16信号通路分子的表达。应用CXCL16 siRNA之后,IL-1β刺激诱导的以上损伤变化均显著减轻。第二部分,DM组大鼠肠道菌群的丰度、多样性较对照组显著下降,其结构较Control组亦明显不同。肠道菌群杀灭或粪菌移植之后,DM大鼠的肾间质损伤均有所减轻,包括尿液ACR和NAG/Cr水平显著降低、肾小管上皮细胞坏死脱落减少。同时,以上两种干预均显著减少了DM大鼠肾间质中的胆固醇沉积,下调肾小管上皮细胞中胆固醇稳态相关蛋白3羟基3甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGR)、低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLr)、清道夫受体CD36和CXCL16的表达。进一步分析发现,DM组大鼠血清中乙酸水平较Control组显著升高,肠道菌群杀灭或粪菌移植均显著降低了乙酸水平,并且血清乙酸水平与肾脏胆固醇含量呈正相关(P=0.035,R=0.565),提示DM肠道菌群紊乱产生的过量乙酸可能导致肾间质胆固醇沉积。体外研究中,乙酸刺激显著增加了高糖培养的HK-2细胞中的胆固醇沉积,并上调胆固醇稳态相关蛋白的表达水平。应用siRNA下调GPR43表达,可有效下调HK-2细胞胆固醇稳态相关蛋白的表达,显著减少细胞中的脂质沉积。结论:(1)炎症通过激活CXCL16信号通路,增加肾小管上皮细胞中的胆固醇沉积,加重DN肾间质损伤。(2)肠道菌群生成的乙酸通过作用于GPR43,诱导DM肾小管间质胆固醇稳态失调和损伤,促进DN进展。