目的：　　新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxia ischemic encephalopathy，HIE）是由于围生期窒息导致的缺氧缺血性脑损害，是导致新生儿死亡及神经系统后遗症如脑瘫、智力障碍和癫痫的重要原因，但目前仍然缺乏有效的措施能够改善因围产期窒息所致的神经系统后遗症。近年研究发现，细胞骨架降解在缺氧缺血后神经细胞损伤的发生发展过程中发挥重要作用，而细胞骨架又是介导神经元轴突的发生、延长与再生的关键。神经元细胞骨架的两个重要成分肌动蛋白丝（f-actin）与微管（β-tubulin）分别受Rho/ROCK及AKT/GSK-3β信号通路的调控，因此，本研究将从神经元细胞骨架的整体调控出发，以体外培养的SD大鼠皮层神经元为研究对象，观察氧糖剥夺（OGD）后，分别联合应用ROCK2抑制剂法舒地尔（Fasudil）、GSK-3β抑制剂（TDZD-8）以及两者联合应用对细胞骨架蛋白的保护、神经元突起再生及细胞凋亡的影响，为临床上开发联合用药治疗新生儿缺氧缺血性脑病提供实验依据。　　方法：　　取新生24h SD大鼠，按照Beaudoin的方法将皮层神经元在体外培养至7d后，随机分为5组：正常对照组（不做任何处理），缺氧复氧组（OGD后单纯复氧），Fasudil组（OGD后复氧同时加入Fasudil），TDZD-8组（OGD后复氧同时加入TDZD-8），联合用药组（OGD后复氧同时加入Fasudil与TDZD-8）；参考Alluri的方法建立氧糖剥夺模型（oxygen and glucose deprivation，OGD），各组使用相应药物处理后，用细胞增殖与活性检测试剂盒（CCK8）检测细胞活性，原位末端标记染色法（TUNEL）检测细胞凋亡率，神经元标志性蛋白β-3 tubulin免疫荧光标记下测量神经元突起长度，免疫荧光染色比较f-actin及β-tubulin表达情况，Western Blot检测信号通路蛋白及细胞骨架蛋白ROCKII、p-GSK-3β、f-actin、β-tubulin的表达量。实验结果以均数±标准差(x?s)表示。数据应用SPSS19.0统计软件进行分析，采用单因素方差分析比较组间差异，P<0.05时表示差异具有统计学意义。　　结果：　　⑴通过CCK-8法检测各浓度梯度的细胞活性，确定了Fasudil和TDZD-8的最佳浓度分别是10μmol/L(1.37±0.08,P<0.05)和1μmol/L(1.36±0.08,P<0.05)，并将上诉药物浓度用于进一步研究。与正常对照组相比，缺氧复氧组的细胞活性显著降低(0.58±0.04,P<0.05)，进行药物干预后，Fasudil组（1.37±0.09）和TDZD-8组（1.36±0.08）细胞活性明显提高(P<0.05)；相比单独用药，联合用药组对细胞活性有更显著地提高(1.67±0.06,P<0.05)。⑵正常对照组、缺氧复氧组、Fasudil组、TDZD-8组、联合用药组神经元凋亡率分别是：7.20±1.76，68.34±4.15，40.11±2.74，39.43±2.98，30.46±2.27；结果表明氧糖剥夺后细胞凋亡率显著增加（P<0.05），Fasudil和TDZD-8具有一定神经保护作用，可以减少细胞凋亡（P<0.05），而联合用药能够产生协同作用，进一步降低细胞凋亡率（P<0.05）。⑶利用神经元标志性蛋白β-3 tubulin进行荧光染色，通过Image-Pro-Plus6.0（IPP）测量神经元最长突起长度，进行组间比较。结果显示，与正常对照组(242.37±7.78)相比，缺氧复氧组神经突起长度明显缩短(100.21±10.03,P<0.05)，而Fasudil组和TDZD-8组神经突起长度均大于缺氧复氧组(174.14±5.91,170.79±9.17,P<0.05)，但小于联合用药组(207.00±9.71, P<0.05)，表明联合用药可以更好的保护神经元形态，促进突起再生。⑷为了观察氧糖剥夺及Fasudil与TDZD-8对细胞骨架蛋白的作用，我们通过对f-actin及β-tubulin进行免疫荧光染色，发现氧糖剥夺之后，神经元失去了正常的细胞形态，f-actin及β-tubulin的表达强度显著降低，而Fasudil组和TDZD-8组均可以维持正常的神经元的形态，f-actin及β-tubulin的表达强度均强于缺氧复氧组，但有所差别，Fasudil组在f-actin上有更高的表达强度，而TDZD-8组在β-tubulin的表达上更显著。联合用药组在f-actin及β-tubulin的表达上更加均衡，更接近于正常对照组。⑸氧糖剥夺后，ROCK2表达明显增加，p-GSK3β大幅下调，f-actin及β-tubulin的表达均明显减少（P<0.05）；应用Fasudil后，ROCK2表达显著减少（P<0.05），p-GSK3β表达无明显改变（P>0.05），f-actin及β-tubulin表达均明显增加（P<0.05），但f-actin增加更为显著（P<0.05）；而应用TDZD-8后，p-GSK3β表达显著增加（P<0.05），对ROCK2的表达无明显影响（P>0.05），f-actin及β-tubulin表达增多（P<0.05），以β-tubulin增加更为显著（P<0.05）；与单独用药相比，联合用药在减少ROCK2表达及上调p-GSK3β活性上具有协同作用（P<0.05），f-actin及β-tubulin的表达均比单独用药明显增加（P<0.05）。根据上面的结果，我们推ROCK2及p-GSK3β均参与了OGD诱导的细胞骨架崩解，Fasudil可以通过调节ROCK2保护f–actin，而TDZD-8主要通过抑制GSK3β保护β-tubulin，因此，联合Fasudil和TDZD-8可以更好地保护细胞骨架的完整性。　　结论：　　氧糖剥夺之后，神经细胞骨架被破坏，细胞骨架重要组成蛋白表达量减少，导致神经元突起短缩，细胞凋亡增加。单独应用 Fasudil或 TDZD8后，可以在一定程度上维持细胞骨架形态，减少细胞骨架蛋白降解，促进神经元突起生长，减少细胞凋亡，但与正常神经元相比，仍有一定差距；联合用药具有协同作用，可以更好的保护细胞骨架的完整性，增强神经保护作用。