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背景鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一种高发于我国华南地区的恶性肿瘤,95%以上的NPC与EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)感染密切相关。放化疗为基础的综合治疗是目前主流的治疗方式,但局部进展的NPC 5年复发率在40%以上,复发难治、远处转移的NPC中位总生存时间不足1年。肿瘤免疫治疗,因其低毒性和潜在的治愈性,成为当下研究的热点。PD-1抗体、过继性T细胞回输等免疫治疗,已在NPC显示出初步的疗效。然而,已有的免疫治疗有效率偏低：肿瘤微环境中的抑制性细胞、负向调控分子,是肿瘤免疫逃逸及免疫治疗失败的重要原因。髓源性抑制细胞(myeloid-deprived suppressor cells, MDSC),是一种具有抑制功能的未成熟髓系细胞。MDSC在NPC大量扩增、活化,抑制了杀伤性T细胞的功能,促进了肿瘤的侵袭和转移。STING信号通路,是免疫系统识别细胞质中异常来源的双链DNA,发挥天然免疫的重要通路：疱疹病毒、结核分枝杆菌等病原体的DNA,进入树突细胞的细胞质,该通路被激活,树突细胞合成大量的Ⅰ型干扰素,促进抗原呈递、启动适应性免疫反应。近两年的研究表明：来源于肿瘤的DNA,也可以激活STING信号通路,启动抗肿瘤免疫反应。实验目的研究STING信号通路在NPC的活化状态,探索该通路与MDSC分化的关系及临床意义。实验材料和方法1.检测STING信号通路的活化状态：利用免疫组化、ELSI A (the enzyme-linked immunosorbent assay)、Western blot等,检测临床样本(肿瘤及癌旁组织、患者及健康人血清)和细胞系(癌细胞系、正常鼻咽上皮细胞系)中STING的表达、信号通路的活性。2.分析STING信号通路影响MDSC的分化：利用过表达、siRNA沉默、磷酸化位点突变等技术手段以及癌细胞和CD33+细胞共培养体系,流式检测分析STING信号通路对MDSC分化的影响。收集共培养体系上清,ELISA测定IL-6、GM-CSF、IL-1β等细胞因子。3.筛查调控STING的miRNA:结合生物信息学预测,利用qPCR、Western Blot及荧光素酶报告基因实验,筛查并验证NPC中调控STING的miRNA.4.研究STING信号通路的临床意义：收集临床资料,统计分析STING信号通路与MDSC水平、EB病毒DNA载量、分期、预后等临床指标的相关性。实验结果1. STING信号通路在NPC中下调：癌组织中的STING表达量显著地低于配对的癌旁组织(n=22,p<0.001),患者血清中的STING浓度显著地低于健康人(p=0.025)。癌细胞系(TW03、CNE2)中STING的表达量,低于正常鼻咽上皮细胞系(NP69); HSV-1刺激后,TW03、CNE2中p-TBK1、p-IRF3水平及IFN-β mRNA转录水平,低于NP69。2. STING信号通路的下调促进了MDSC的分化：相比于对照组,过表达STING的TW03,诱导产生的MDSC数目明显减少(p<0.05),对T细胞增殖的抑制能力明显减弱(p<0.05)；利用siRNA技术敲低TW03中的STING或将STING磷酸化位点突变,诱导MDSC的结果正好相反。患者肿瘤组织中,STING与CD33的表达量,呈显著的负相关(n=50,p<0.001).3.miR-24调控STING的表达：生物信息学预测,STING是miR-24的直接作用靶点；TW03、CNE2细胞系中过表达miR-24,可下调STING mRNA的转录及STING蛋白的表达；荧光素酶报告基因实验证实,miR-24可直接结合STING 3’UTR。4.肿瘤组织中STING表达的临床意义：患者肿瘤组织中STING的表达量,与血清中STING的浓度线性相关(n=50,r=0.5928,P<0.0001),与基线EB病毒DNA载量负相关(n=50,P=0.041),与接受同步放疗后的无复发生存时间正相关(n=89,p=0.041)。结论：STING信号通路在鼻咽癌中下调,促进了MDSC的分化,增强了MDSC的免疫抑制功能,是患者预后不良的因素之一。此外,miR-24在鼻咽癌中过表达,可能是STING表达下降的原因之一。