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随着蛋白质技术研究的日益深入,开发高效、快速地分离技术已成为生物工程技术领域的一个重要研究课题,传统的过滤、离心、萃取、透析等分离方法对生物分子缺乏选择性,而电泳和层析技术需要很多繁杂的样品预处理过程,最终导致蛋白质分离损耗增加和回收率的降低。磁性纳米颗粒的出现有效地解决了上述问题,由于其具有尺寸小、比表面积大、表面活性高以及对外加磁场的快速响应性等优良特性,在生物大分子的分离纯化领域显示出巨大的应用潜力。磁性纳米颗粒经过适当的表面修饰,可以高度选择性地结合目标蛋白,在解决蛋白质的快速分离以及高特异性的选择性分离方面具有明显的优势。
本论文在前人的基础上,制备了两种新型的功能型磁性复合颗粒,分别是染料亲和磁性复合颗粒和温敏性磁性复合颗粒,然后将这两种功能复合材料作为吸附剂,并系统地探讨了二者对于蛋白质的吸附性能,主要内容包括:
1.采用化学共沉淀法制备了具有超顺磁性的γ-Fe2O3纳米颗粒。用含有多种官能基团的生物相容性材料壳聚糖对其进行包裹,通过亲核反应将活性染料Reactive Red 120键和到壳聚糖包裹的磁性纳米颗粒上,成功地制备出一种新型的染料亲和磁性复合颗粒。通过SEM、FTIR、XRD、TGA和VSM等手段对该新型染料亲和磁性复合颗粒进行表征。结果显示:制备的新型染料亲和磁性复合颗粒平均粒径为3μm左右,具有良好的超顺磁性,最大比饱和磁化强度为13.6emu/g,满足磁分离的要求。而且其表面含有丰富的磺酸基、羟基和亚氨基等活性基团,可以作为磁性载体、磁性吸附剂等多功能的磁性复合材料在生物化工等工业领域内使用。
2.以菠萝蛋白酶为模型蛋白,以制备的染料亲和磁性复合颗粒为吸附剂,系统研究了染料亲和磁性复合颗粒对菠萝蛋白酶的吸附实验。探讨了染料亲和磁性复合颗粒对菠萝蛋白酶的最佳吸附条件。同时将磁性纳米颗粒、壳聚糖包裹的磁性纳米颗粒以及染料亲和磁性复合颗粒对菠萝蛋白酶的吸附效果进行比较。结果表明:当溶液pH为8.5时,蛋白质吸附量最大;通过比较活性染料修饰前后的磁性纳米颗粒对菠萝蛋白酶的吸附效果,证明表面的化学修饰可以显著提高磁性吸附剂的吸附性能。另外通过染料亲和磁性复合颗粒的解吸、再生和重复利用的研究表明染料亲和磁性复合颗粒可反复使用,期间吸附率未出现过多的损失。在此基础上,利用等温吸附、吸附动力学和吸附热力学模型,同时结合FTIR和Zeta电位分析方法,分别从理论和微观角度,首次对染料亲和磁性复合颗粒吸附剂的吸附机理进行详细地研究。等温吸附和动力学理论研究均表明温度升高有利于染料亲和磁性复合颗粒吸附剂的吸附,吸附焓变(△H)和吉布斯自由能变(△G)的研究认为吸附是一个吸热自发的过程。再结合FTIR和Zeta电位方法研究表明染料亲和磁性复合颗粒吸附剂对菠萝蛋白酶的吸附是由于静电作用、疏水作用以及氢键等多种作用力共同驱动的结果。
3.根据St(o)ber法在磁性纳米颗粒表面修饰一层二氧化硅,然后利用分散聚合法,在磁性二氧化硅复合颗粒的表面包覆上一层新型的温敏性聚合物材料——聚N-乙烯基己内酰胺,得到了一种新型的温敏性磁性复合颗粒。通过SEM、FTIR、XRD、VSM、TGA和DSC等手段对该温敏性磁性复合颗粒进行表征。结果表明,制备的新型温敏性磁性复合颗粒形态规整,呈标准的球形状,平均粒径5μm左右。最大比饱和磁化强度为为9.82emu/g。新型温敏性磁性复合颗粒中温敏性聚合物聚N-乙烯基己内酰胺的含量为6.63%,且包裹了γ-Fe2O3/SiO2的聚N-乙烯基己内酰胺对外界温度的变化仍具有明显的响应性,其LCST为33.4℃,接近于人体的生理温度。
4.以新型温敏性磁性复合颗粒为吸附剂,以牛血清白蛋白为模型蛋白,对温敏性磁性复合颗粒吸附剂吸附牛血清白蛋白的吸附性能进行系统的研究。探讨吸附时间、pH值、离子强度以及BSA的初始浓度对温敏性磁性复合颗粒吸附剂吸附量的影响,并考察了温度对功能型吸附剂的吸附解吸性能的影响。实验结果表明:在吸附时间为3h,溶液pH为5.0,BSA的初始浓度为1.6mg/mL时,蛋白质的吸附量最大为(76.49mg/g)。最适吸附温度为35℃,温敏性磁性复合颗粒吸附剂对牛血清白蛋白的吸附行为满足Freundlich模型。上述实验分析表明制得的温敏性磁性复合颗粒是一款大吸附量、高吸附效率和具有良好超顺磁性的双功能型磁性吸附剂。