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目的:本课题通过实验研究解郁育胞方对慢性应激大鼠子宫内膜容受性的干预作用,并探讨其作用机理。旨在探索临床不孕患者因生活环境、不孕本身、或由试管婴儿(IVF-ET)失败等造成心理压力引起子宫内膜容受性低下的机理,为临床应用疏肝养肝法治疗不孕证及辅助生殖技术(ART)的中医辅助治疗,从而提高受孕成功率,提供理论依据。方法:本研究以SPF级Sprague-Dawley(SD)系大鼠为研究对象,通过建立慢性应激模型,采用解郁育胞方对子宫内膜容受性进行实验研究。选择有正常动情周期的8周龄SD雌性大鼠纳入实验,进入SPF级屏障系统动物实验室,按体重分层法随机分为5组,每组16只。包括A组正常对照组(A正常组),B组模型对照组(B模型组),C组解郁育胞方低剂量组(C解低组),D组解郁育胞方中剂量组(D解中组),E组解郁育胞方高剂量组(E解高组)。除A正常组外,其余4组大鼠采用慢性轻度不可预见性应激模型造模,接受14日不同应激源刺激,包括行动受限(2h)、夹尾(1min,3次/日)、冰水游泳(4℃,5min)、噪音(75d B,1h)、禁食(24h)、禁水(24h)、电击足底(电压50m V,每隔50s刺激1次,每次持续10s,共30次)。每日随机选择2种刺激。造模14日后大鼠出现倦怠懒动,进食兴趣降低,修饰行为(抬举、抓痒、舔足等)减少,提示造模成功。各组持续刺激至合笼日,共28日。D解中组:于刺激第15日开始,每日9:00给予解郁育胞方溶液(相当于生药1g·m L-1)灌胃,按体表面积折算临床有效剂量,给药容量为11.2m L·kg-1,每日1次,至处死日。C解低组:于刺激第15日开始,每日9:00给予解郁育胞方溶液灌胃,按D解中组所折算临床有效剂量的1/2给药,给药容量为5.6m L·kg-1,每日1次,至处死日。E解高组:于刺激第15日开始,每日9:00给予解郁育胞方溶液灌胃,按D解中组折算临床有效剂量的2倍给药,给药容量为22.4m L·kg-1,每日1次,至处死日。A正常组、B模型组于第15日每日9:00灌服临床有效剂量等体积蒸馏水,容量为11.2m L·kg-1,每日1次,直至处死日。五组大鼠分别于第28日16:00雌雄2:1合笼,次日晨9:00时检查阴栓,并进行阴道涂片检查,涂片发现精子或阴栓者记为妊娠第1日。各组达到妊娠第4日(处死日)的8只大鼠,于当日16:00摘眼球取血3-5m L,30min内于1000*g离心15min,取上清液,按使用说明书检测β-内啡肽(β-EP)含量。取血结束后采用颈椎脱臼法处死大鼠,剖取并分离子宫,将子宫内膜沿纵轴剖开,展平,反复用生理盐水冲洗后,取单侧子宫放入4%戊二醛固定,石蜡包埋,切片,HE染色,制成透射电镜标本,观察子宫内膜胞饮突。取另侧子宫分切成上、下2段,上段置于10%多聚甲醛中固定,运用免疫组化SP法,检测各组大鼠子宫内膜血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平;下段子宫取出后立即置于-80℃冰箱保存,实时荧光定量聚合酶链技术(Real-Time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)测HOXA-10m RNA含量。各组剩余8只大鼠于合笼第10日16:00全部颈椎脱臼法处死,剖取子宫,统计妊娠率和平均胚胎数。结果:1.各组大鼠一般情况观察造模14日后,B模型组和C解低组大鼠出现神态倦怠,眼目无神,扎堆懒动,造模时抗争不积极,修饰行为(抬举、抓痒、舔足等)减少,摄食量减少,大便性状改变(干结或稀溏),毛色无光泽等表现。说明应激对大鼠情绪和行为造成了一定的影响。A正常组、D解中组、E解高组毛色光洁整齐,活泼好动,眼睛有神,摄食正常,体重上升较迅速。直至实验结束,各组大鼠用药期间均未发现明显不良反应,应激结束后各组大鼠无死亡。2.各组大鼠动情周期变化于造模第15日进行阴道涂片,连续观察大鼠动情周期变化14日。B模型组表现为动情周期延长,主要为动情间期延长,显微镜下观察大量白细胞、少量有核退化上皮细胞和黏液出现的时间延长。B模型组和C解低组的动情周期比A正常组明显延长(P<0.05)。D解中组、E解高组与B模型组相比,动情周期缩短(P<0.05);与A正常组相比无明显差异(P>0.05)。C解低组与E解高组、D解中组相比,动情周期有明显差异(P<0.05)。3.各组大鼠血清β-EP比较B模型组大鼠血清β-EP的含量比A正常对照组明显增加(P<0.05),证明造模成功;与A正常组比较,C解低组的β-EP含量明显升高,差异有显著统计学意义(P<0.05);而D解中组、E解高组与A正常组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与B模型组比较,解郁育胞方各实验组(低、中、高三组)的β-EP含量均低于B模型组,均高于A正常组,D解中组、E解高组与B模型组比较有显著差异(P<0.05),而C解低组与B模型组比较β-EP含量无明显差异(P>0.05);D解中组、E解高组的β-EP含量明显低于C解低组(P<0.05)。D解中组、E解高组之间无明显差异(P>0.05)。4.透射电镜下各组大鼠子宫内膜上皮细胞胞饮突表达与A正常对照组相比,B模型组、C解低组、D解中组的胞饮突评分下降,其中B模型组、C解低组与A正常对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05),D解中组与A正常组无明显差异(P>0.05);而E解高组胞饮突评分比A正常组略高,差异无统计学意义(P>0.05)。与B模型组相比,解郁育胞方各实验组(低、中、高三组)胞饮突评分均较B模型组增高,D解中组、E解高组的胞饮突评分明显高于B模型组(P<0.05);D解中组、E解高组的胞饮突评分明显高于C解低组(P<0.05);D解中组、E解高组之间无明显差异(P>0.05)。5.各组大鼠子宫内膜HOXA-10m RNA的表达子宫内膜HOXA-10m RNA含量通过计算标本HOXA-10m RNA与β-Actin m RNA的比值测定。HOXA-10m RNA在5组子宫内膜和蜕膜组织中均有表达,A正常组值为0.965±0.102,B模型组为0.6583±0.031,C解低组值为0.7983±0.017,D解中组值为0.8663±0.125,E解高组值为0.8246±0.317。HOXA-10m RNA在不同条件下大鼠子宫内膜中的相对含量显示,与A正常组相比,B模型组和C解低组HOXA-10m RNA的表达水平显著下降(P<0.05)。与B模型组比较,C解低组、D解中组、E解高组的HOXA-10m RNA的表达水平均显著提高,有统计学意义(P<0.05)。与C解低组比较,D解中组、E解高组的HOXA-10m RNA的表达水平无明显差异(P>0.05)。D解中组、E解高组之间HOXA-10m RNA的表达水平无明显差异(P>0.05)。6.各组大鼠子宫内膜VEGF比较VEGF主要表达于子宫内膜腺上皮细胞和部分基质血管内皮细胞的胞浆,部分间质细胞亦呈现弱着色,各试验组表达强弱不一。与A正常组相比,B模型组VEGF的表达明显降低(P<0.05),说明慢性应激对大鼠的子宫内膜血管生成有抑制作用。解郁育胞方实验组(低、中、高三组)与正常对照组VEGF的表达相比较差异无显著统计学意义(P>0.05),但与B模型组相比有明显差异(P<0.05)。解郁育胞方实验组(低、中、高三组)之间VEGF的表达无明显差异(P>0.05)。7.各组大鼠妊娠数及着床数比较各组大鼠经过10日合笼,A正常组、D解中组、E解高组均全部妊娠,B模型组和C解低组各有1只大鼠仍未妊娠。与A正常组相比,B模型组与C解低组的大鼠平均着床点数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。D解中组和E解高组的平均着床点数与A正常组无明显差异(P>0.05)。与B模型组相比,D解中组和E解高组的平均着床点数明显增高(P<0.05);与C解低组相比,D解中组和E解高组的平均着床点数明显增高(P<0.05);D解中组和E解高组之间的平均着床点数无明显差异(P>0.05)。结论:1.B模型组大鼠的行为学、动情周期、血β-EP等指标发生改变,造模成功;2.慢性应激能够对大鼠子宫内膜容受性的相关指标(VEGF、子宫内膜上皮细胞胞饮突、HOXA-10m RNA的表达)产生影响;3.解郁育胞方能够改善大鼠的应激状态(一般状态,动情周期,血β-EP等);4.解郁育胞方对应激所造成的子宫内膜容受性指标胞饮突、VEGF、HOXA-10m RNA表达具有改善作用,且呈现剂量依赖性的特点。因此,我们推测解郁育胞方可能通过改善大鼠的应激状态,改善慢性应激大鼠子宫内膜容受性相关因子的表达,从而改善子宫内膜容受性,进而增加大鼠妊娠率、着床点数。