论文部分内容阅读
丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)是一种工业生产中广泛使用的化学毒物,人们在工作场所中或者摄入经高温加热后的淀粉类食物时都有可能接触ACR。ACR具有许多毒性,例如神经毒性、生殖毒性、致癌性和遗传毒性,但在人群中主要是神经毒性。大量研究发现ACR主要的神经毒效应涉及在轴突运输中起关键作用的细胞骨架蛋白。微管(Microtubule,MT)是细胞骨架的主要成分之一,主要包含两个亚基,β-tubulin和α-tubulin。MT主要参与细胞形态的维持、细胞内物质运输以及信号的转导,MT的损伤易引起神经元的死亡从而导致神经退行性病变。钙蛋白酶(Calpain)在ACR诱导的MT损伤以及神经退行性病变中发挥重要作用,但其具体的机制仍不明确,可能和其能够影响Tau、微管相关蛋白2(Microtubule-associated Protein2,MAP2)、蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)和细胞周期蛋白依赖性激酶5(Cyclin-dependent Kinase 5,CDK5)有关。并且Calpeptin(CP)作为一种Calpain抑制剂受到越来越多的关注。目的通过建立ACR中毒和CP干预模型,观察大鼠神经行为和组织形态的变化,检测坐骨神经中tubulin、Calpain、微管相关蛋白以及相关激酶的变化,探讨CP对ACR诱导的MT损伤的干预作用及机制。方法1.动物模型的建立将40只雌性Wistar大鼠经适应性饲养后随机分为4组(Control组、CP组、ACR组和ACR+CP组),通过腹腔注射的方式将1 ml/kg·bw的生理盐水、30 mg/kg.bw的ACR和200 μg/kg.b 的CP给予对应大鼠,每周3天(生理盐水和ACR每天1次、CP每天2次),为期4周。给药结束后,将大鼠处死,取坐骨神经备用。2.体重和神经行为学指标的测定给药期间每周测量体重和神经行为学指标(步态评分、后肢撑力、转棒实验)。3.蛋白水平的测定通过蛋白印迹检测各组坐骨神经中β-tubulin、α-tubulin、Calpain Ⅰ、Calpain Ⅱ、Tau、MAP2、PKC和CDK5的蛋白含量;通过免疫组织化学检测上述蛋白在坐骨神经中的表达。4.组织形态观察通过HE染色观察坐骨神经的组织形态变化。5.统计分析所有实验数据均用X±S表示,并采用SPSS 23.0进行统计学分析。体重、后肢撑力和转棒实验的数据用重复测量资料的方差分析(Repeated Measures Analysis of Variance)进行分析;步态评分的数据用广义估计方程(Generalized Estimated Equation)进行分析;各蛋白含量的数据通过单因素方差分析(One-Way Analysis Of Variance)进行分析;组间两两比较采用LSD-t或Dunnett-t法。P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.体重给药4周后,Control组大鼠体重增加了 30.3%,CP组体重增加了28.2%,ACR组体重增加了 18.7%,ACR+CP组体重增加了 25.8%;与Control组相比,ACR组体重明显更低(P<0.05);而ACR+CP组体重明显高于ACR组(P<0.05)。2.神经行为学指标给药4周后,与Control组相比,ACR组大鼠出现了双脚拖地、后肢瘫痪等现象,并且步态评分得分明显增高(P<0.05)、后肢撑力指数明显增大(P<0.05)、转棒实验时间明显缩短(P<0.05);而ACR+CP组步态评分和后肢撑力指数都明显低于ACR组(P<0.05)。3.蛋白水平的变化(1)β-tubulin和α-tubulin蛋白水平的变化蛋白印迹结果显示,与Control组相比,ACR组坐骨神经中β-tubulin含量升高了22.0%(P<0.05);而ACR+ CP组较ACR组β-tubulin的含量降低了 16.0%(P<0.05)。免疫组织化学结果显示,与Control组相比,ACR组β-tubulin过度表达;而与ACR组相比,ACR + CP组β-tubulin过表达明显减少。蛋白印迹和免疫组织化学结果均显示4组间α-tubulin蛋白水平无显著性差异。(2)Calpain I和Calpain Ⅱ蛋白水平的变化蛋白印迹结果显示,与Control组相比,ACR组Calpain I和Calpain II含量分别升高了 53.1%(P<0.05)和28.1%(P<0.05);而ACR + CP组较ACR组Calpain I和Calpain II含量分别降低了 26.3%(P<0.05)和 18.1%(P<0.05)。免疫组织化学结果显示,与Control组相比,ACR组Calpain I和Calpain II都过度表达;而与ACR组相比,ACR+ CP组Calpain I和Calpain II过表达明显减少。(3)Tau和MAP2蛋白水平的变化蛋白印迹结果显示,与Control组相比,ACR组Tau和MAP2含量分别升高了 37.3%(P<0.05)和38.8%(P<0.05);而ACR+CP组较ACR组Tau和MAP2含量分别降低了 15.4%(P<0.05)和17.2%(P<0.05)。免疫组织化学结果显示,与Control组相比,ACR组Tau和MAP2都过度表达;而与ACR组相比,ACR+CP组Tau和MAP2过表达明显减少。(4)PKC和CDK5蛋白水平的变化蛋白印迹结果显示,与Control组相比,ACR组PKC和CDK5含量分别升高了 149.9%(P<0.05)和44.4%(P<0.05);而ACR+ CP组较ACR组PKC和CDK5含量分别降低了 56.5%(P<0.05)和15.2%(P<0.05)。免疫组织化学结果显示,与Control组相比,ACR组PKC和CDK5都过度表达;而与ACR组相比,ACR+CP组PKC和CDK5过表达明显减少。4.组织形态观察经HE染色并在高倍显微镜(400×)下观察,Control组与CP组之间无明显差异,两组坐骨神经横截面完整,结构有序,排列紧密,染色均匀;ACR组坐骨神经横截面不完整,排列松散,结构混乱,密度不均匀,神经束膜脱落;ACR+CP组坐骨神经横截面相对完整,排列较紧密,结构相对有序,神经束膜脱落不明显。结论1.成功建立了大鼠ACR中毒模型和CP干预模型。2.CP对ACR引起的坐骨神经中Calpain、蛋白激酶、MAPs以及tubulin异常改变具有干预作用。3.CP可能通过抑制Calpain-PKC/CDK5-MAPs-tubulin通路干预ACR对坐骨神经MT的损伤。