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核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一种世界性、毁灭性植物病原真菌,引起的菌核病是我国油料和蔬菜作物生产最严重的病害之一。尽管如此,植物对核盘菌抗性机理的认识还不够深入。植物依靠细胞表面的模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)识别病原物相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和植物自身损伤相关分子模式(Damage-associated molecular patterns,DAMPs)分别触发PTI(PAMP-triggered immunity)和DTI(DAMP-triggered immunity)免疫。但目前植物对死体营养型病原物的免疫研究尚浅。本论文以一类新DAMP——快速碱化因子(Rapid alkalinization factors,RALFs)的核盘菌免疫功能分析为切入点,研究RALF22在油菜和拟南芥抗核盘菌免疫中的作用及分子机制。获得的主要结果如下:(1)阐明了RALF22在拟南芥抗核盘菌免疫中的作用及机制。利用拟南芥RALF22基因超表达和突变体植株及合成的RALF22成熟肽处理植株的功能分析,明确了RALF22正调控对核盘菌的抗性。合成的RALF22肽能激发多种十字花科作物(油菜、白菜、甘蓝)产生对核盘菌的抗性,并激发活性氧(Reactive oxygen species,ROS)产生、胞内Ca2+激增、MAPK(Mitogen-activated protein kinase)磷酸化、胼胝质沉积及抗性标志基因表达等PTI免疫反应。RALF22的免疫激发和抗核盘菌功能依赖于FER(FERONIA)。RALF22的识别共受体LLG1(LORELEI(LRE)-like GPI-anchored protein1)、呼吸迸发氧化酶RBOHD(Respiratory burst oxidase homolog D)以及激活RBOHD的磷酸激酶BAK1(Brassinosteroid-insensitive 1(BRI1)associated receptor kinase 1)、BIK1(Botrytis-induced kinase 1)及RIPK(RPM1-induced protein kinase)、过氧化氢酶CAT2(Catalase 2)在RALF22诱导的ROS迸发和积累中起重要作用。C端半胱氨酸在RALF22诱导的ROS迸发及核盘菌抗性中起关键作用。通过RALF22与At Pep3(Arabidopsis thaliana plant elicitor peptide 3)协同效应及转录调控分析,揭示RALF22增强At Pep3的ROS和抗核盘菌激发功能,RALF22可能通过强烈增加At Pep3转录本放大At Pep3激发的免疫信号。(2)揭示了RALF受体FER直接通过天冬酰胺合成酶2(Asparagine synthetase 2,ASN2)正调控抗核盘菌免疫。利用免疫共沉淀偶联质谱分析技术(IP-MS)鉴定获得与FER可能结合的下游蛋白天冬酰胺合成酶(ASN2),并利用Y2H(Yeast two-hybrid)、Bi FC(Bimolecular fluorescence complementation)、LCA(Luciferase complementation assay)、Co-IP(Co-immunoprecipitation)等多种分析蛋白相互作用的技术手段证明了FER与ASN2直接相互作用。拟南芥ASN2基因超表达植株及突变体植株的接种分析结果表明,ASN2正调控核盘菌抗性。(3)从基因组水平鉴定了油菜RALF与Cr RLK1L(Catharanthus roseus receptor-like kinase)家族,揭示了Bn RALF10和Bn FER1在抗核盘菌免疫中的功能及机制。油菜基因组含61个Bn RALFs以及45个Cr RLK1Ls基因,分别分为4个和5个群组。明确了61个油菜RALF基因对核盘菌侵染、Ssnlp1与Bn Pep5处理的响应表达谱,约40%基因对这些处理有明显表达响应。Bn RALF10为拟南芥RALF22的油菜直系同源基因(ortholog)。合成的Bn RALF10成熟肽可诱导ROS产生、胞内Ca2+激增等PTI免疫反应及对核盘菌的抗性。通过Y2H、Bi FC、LCA等蛋白互作分析以及遗传学分析,证明了Bn FER1为Bn RALF10的受体。通过VIGS(Virus-induced gene silencing)及油菜转基因材料功能分析,明确了Bn RALF10和Bn FER1基因在油菜对核盘菌抗性中的正调控作用。通过油菜叶片蛋白质组学分析,鉴定获得314个Bn RALF10合成肽与dd H2O处理差异表达蛋白。分泌途径、氧化还原、Ca2+等免疫信号、MAPK信号途径等可能参与Bn RALF10激发抗核盘菌免疫的调控。(4)阐明了p H在植物与核盘菌互作中的重要作用,初步揭示了p H影响植物-核盘菌互作的分子机制。通过分析p H对核盘菌生长及致病力的影响,明确了p H与核盘菌生长及致病力呈负相关,酸性条件利于核盘菌生长及侵染寄主。通过不同p H营养液培养的油菜接种分析,发现p H与油菜对核盘菌的抗性呈正相关,碱性环境利于油菜抗菌核病。油菜叶片及叶内核盘菌菌丝的ROS稳态积累水平与环境p H呈负相关,高p H抑制了ROS稳态积累。转录组分析结果显示,不同p H营养液培养导致油菜中基因转录重新编程,高p H使MAPK信号途径、激素信号途径、植物病原物互作、氧化还原平衡等过程的基因转录导向清除ROS及提高抗病性方向。综上,本研究阐明了RALF22在植物抗核盘菌免疫中的作用及分子机制,明确了p H对油菜-核盘菌互作的重要影响,揭示了植物抗核盘菌免疫新机制,为菌核病的绿色防控提供新策略。