研究背景脂肪间充质干细胞(Adipose Tissue-Derived Stem Cell,ADSC)是从脂肪组织中分离出来的一种中胚层来源的多能干细胞。因其具有来源充足、取材方便、易于培养、多向分化和免疫调节等众多优点,已成为间充质干细胞研究与应用的热点。ADSC可用于多种组织器官的损伤修复和再生,例如用于皮肤、骨与软骨、肌腱与韧带、周围神经等组织的损伤修复等。ADSC的增殖、多向分化、向损伤部位迁移等生物学特性是影响其发挥损伤修复功能的关键因素。应用间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell,MSC)治疗组织损伤时,往往是在炎症环境中发挥其损伤修复的功能,炎症因子将影响MSC的生物学特性进而影响其组织修复与再生功能。因此,炎症环境下ADSC生物学特性的改变和调节也受到越来越多的关注。近年来的研究发现长链非编码RNA(Long Noncoding RNA,lncRNA)在调控干细胞基因表达的复杂网络中扮演着重要的角色。lncRNA-ANCR/DANCR(Anti-differetiationNoncodingRNA,ANCR)在人体多种组织中广泛表达,并在不同组织来源的干细胞中发挥着不同的调节作用。例如研究发现ANCR可以抑制表皮分化,抑制人骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell,BMSC)的成骨分化以及牙体组织来源干细胞(Dental Tissue-Derived Stem Cell,DTSC)的成脂、成骨和成神经分化,却促进滑膜组织来源的间充质干细胞(Synovium-Derived MSC,SMSC)的增殖和成软骨分化。ANCR对人ADSC(hADSC)生物学特性的影响还尚未见报道。此外,我们在前期研究中发现与炎症密切相关的地塞米松促进ANCR在hADSC中的表达,猜测ANCR可能也会受到微环境中炎症因子的调控。因此,筛选影响ANCR表达的炎症因子后,我们应用地塞米松和TNF-α刺激hADSC,观察ANCR在hADSC生物学特性发生改变过程中的作用,并初步探讨了相关机制。本研究丰富了炎症环境下hADSC生物学特性发生改变的相关机制的研究,为hADSC在组织损伤中的应用提供理论基础。研究目的1.探讨ANCR对hASC增殖、周期、凋亡、迁移以及成脂、成骨分化等生物学特性的调控作用。2.检测地塞米松对hADSC中ANCR表达水平的影响,探讨ANCR在地塞米松诱导的hADSC细胞生物学特性改变中发挥的作用。3.筛选影响hADSC中ANCR表达的炎症因子,探讨ANCR在TNF-α诱导的hADSC细胞生物学特性改变中发挥的作用。4.初步探讨TNF-α、地塞米松调控hADSC中ANCR表达的机制。研究方法1.ANCR对hADSC生物学特性的影响从抽脂术后废弃的脂肪组织中获取血管基质成分SVF(Stromal Vascular Fraction),并用干细胞培养基重悬后贴壁培养获得hADSC。流式分析仪对P3代hADSC进行表面标志物的检测。构建ANCR的敲减与过表达质粒,利用慢病毒感染的方式敲减和过表达hADSC中的ANCR后,CCK-8法检测hADSC增殖、Muse细胞状态分析仪检测细胞周期、Annexin-V和7-AAD染色之后用Muse细胞状态分析仪检测细胞凋亡水平的变化、细胞划痕实验检测细胞迁移能力的改变、成脂诱导后7天进行油红O染色鉴定成脂效果、成骨诱导后14天进行茜素红染色鉴定成骨效果。此外,采用Real-time PCR检测ANCR敲减以及过表达之后hADSC中增殖相关基因(C-FOS,C-JUN)、周期调控基因(P53,P21,CHEK1)、细胞凋亡调控基因(Caspase8,Caspase3,NF-κB,Bcl-2)、趋化因子受体(CXCR4,CXCR7)、成脂分化关键转录因子、脂类合成酶基因以及成骨分化关键转录因子等的表达。2.地塞米松对hADSC生物学特性的影响以及ANCR在其中的作用体外添加1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L三种浓度的地塞米松处理hADSC后,检测hADSC的增殖、周期、凋亡、迁移等生物学特性的改变,以及Real-time PCR 检测各组 hADSC 中 ANCR、成脂相关基因(PARy,C/EBPα)、成骨相关基因(RUNX2,ALP)、增殖、周期、凋亡相关基因以及趋化因子受体(CXCR4,CXCR7)的表达。将hADSC中ANCR敲减后添加1×10-7mol/L的地塞米松处理并检测hADSC增殖、周期和迁移的改变,Real-timePCR检测增殖、周期相关基因以及趋化因子受体CXCR4与CXCR7的表达。3.TNF-α对hADSC生物学特性的影响以及ANCR在其中的作用体外分别添加TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6、IL-8、MCP-1六种促炎因子以及IL-13、IL-10两种抑炎因子,Real-time PCR检测hADSC中ANCR的表达。体外添加10ng/ml和50ng/ml的TNF-α处理hADSC后,检测hADSC的增殖、周期、凋亡、迁移、成脂、成骨分化等生物学特性的改变,以及Real-timePCR检测各组hADSC中增殖、周期、凋亡、迁移、成脂以及成骨相关基因的表达。在hADSC中过表达ANCR后添加10 ng/ml TNF-α刺激并检测hADSC增殖、周期和迁移的改变,Real-time PCR检测增殖、周期和迁移相关基因的表达。4.TNF-α、地塞米松调控hADSC中ANCR表达的机制10 ng/ml TNF-α刺激hADSC,不同时间点收集细胞,Western Blot检测NF-κB(Nuclear factor κB)和 mTOR(Mammalian Target of Rapamycin)信号通路活化情况。分别应用NF-κB通路的抑制剂BAY11-7082、地塞米松以及mTOR通路抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)和PP242预处理hADSC,再加入10 ng/ml TNF-α刺激后,Western Blot检测相应信号通路是否被抑制以及Real-time PCR检测ANCR的表达水平。研究结果1.ANCR对hADSC生物学特性的影响P3代hADSC中,MSC表面标志分子CD44、CD73、CD90、CD105等的表达均在95%以上,CD45等造血干细胞表面标志物的表达为阴性。敲减ANCR促进hADSC的增殖,增加S期的细胞比例、降低G0/G1期的细胞比例,促进hADSC的迁移以及成脂、成骨分化。过表达ANCR抑制hADSC的增殖,降低S期的细胞比例、增加G0/G1期的细胞比例,抑制hADSC的迁移以及成脂、成骨分化。敲减和过表达ANCR对hADSC的细胞凋亡状态都无显著影响。2.地塞米松对hADSC生物学特性的影响以及ANCR在其中的作用地塞米松促进hADSC中ANCR的表达,并且随着地塞米松浓度的增加而升高。高浓度地塞米松(1×10-6mol/L,1×10-7mol/L)抑制hADSC的增殖,减少S期的细胞比例、升高G0/G1期细胞比例,抑制hADSC的迁移,促进hADSC的凋亡以及成脂相关基因PPARγ和C/EBPα的表达。低浓度地塞米松(1×10-8mol/L)促进hADSC中成骨相关基因RUNX2和ALP的表达,对hADSC增殖、周期、凋亡以及迁移没有显著的影响。敲减ANCR可以减弱1× 10-7 mol/L地塞米松对hADSC增殖、周期、迁移的抑制作用。3.TNF-α对hADSC生物学特性的影响以及ANCR在其中的作用TNF-α、IL-1β、IFN-y 可以降低 hADSC 中 ANCR 的表达水平。10 ng/ml 和 50 ng/mlTNF-α促进hADSC增殖,增加S期的细胞比例、降低G0/G1期的细胞比例,促进hADSC中凋亡抑制因子NF-κB的表达及其凋亡拮抗作用,促进hADSC细胞迁移能力,抑制hADSC成脂、成骨分化。ANCR的过表达可以减弱TNF-α对hADSC细胞增殖、周期、迁移的促进作用。4.TNF-α、地塞米松调控hADSC中ANCR表达的机制TNF-α可以激活hADSC中NF-κB和mTOR信号通路,NF-κB和mTOR通路的活化可以分别被BAY11-7082、地塞米松以及Rapamycin、PP242抑制。BAY11-7082和地塞米松可以抑制TNF-α诱导的hADSC中ANCR的下降,并且单独作用时可以通过抑制NF-κB信号通路促进hADSC中ANCR的表达,Rapamycin和PP242则无此作用。研究结论1.ANCR可以调控hADSC的增殖、周期、迁移以及成脂、成骨分化能力。2.地塞米松浓度依赖性的促进hADSC中ANCR的表达,并且敲减ANCR可以减弱1×10-7mol/L地塞米松对hADSC增殖、周期以及迁移的抑制作用。提示ANCR可能参与高浓度地塞米松对hADSC增殖、周期以及迁移的调控。3.促炎因子TNF-α可以降低hADSC中ANCR的表达,并且ANCR的过表达可以减弱TNF-α对hADSC增殖、周期以及迁移的促进作用。提示ANCR可能会参与TNF-α对hADSC增殖、周期以及迁移的调控。推测ANCR的下降与炎症环境下hADSC增殖、迁移能力的变化密切相关。4.NF-κB信号通路可以调节ANCR的表达,1×10-7 mol/L地塞米松可以通过抑制NF-κB通路的激活促进hADSC中ANCR的表达,并且可以抑制TNF-α所引起的NF-κB信号通路的激活来拮抗TNF-α诱导的ANCR下降。