结核(TB)仍然是危害人类生命健康的重大传染病之一,针对TB感染的发生机制和防治方法的研究一直是科学家关注的重大前沿课题。多重耐药结核菌株的出现、HIV感染及卡介苗预防效果的不佳导致结核发病率逐年增加。卡介苗(BCG)是目前临床上唯一应用于预防结核的疫苗,然而研究提示,BCG除了对儿童播散型结核有一定预防作用外,BCG并不能有效预防成人肺结核病的发生。大量研究表明,BCG产生的保护力,随着年龄增长而下降,在青少年和成年后再次接种BCG其作用也非常有限。全世界范围内消除结核最经济有效的手段是接种疫苗,但目前的问题是缺乏有效的疫苗。研究表明,Th1细胞介导的细胞免疫应答在结核防御效应中发挥最为重要作用,Th1细胞主要通过分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α等细胞因子介导抗结核菌保护性免疫应答;然而,结核特异性Th1细胞存在异质性,产生不同细胞因子类型及数目的Th1细胞亚群所发挥效应功能及免疫记忆特性亦存在着差异。人们在对慢性病毒感染性疾病的研究中发现,能同时分泌多种细胞因子的多功能性T细胞与保护效应和疾病预后相关。在结核感染过程中,虽然大量研究提示多功能性T细胞可能介导抗结核保护效应,但目前还没有定论。　　 结核性胸膜炎是肺外结核的常见疾病,在发展中国家,结核感染是导致胸腔积液的最常见原因。由于当前诊断方法灵敏度、特异性低、耗时,对于结核性胸膜炎的及时诊断仍是困扰临床医生的棘手问题。结核性胸膜炎的发病局限于胸膜腔同时合并胸液和炎症细胞的大量聚集,标本易获得,且大多数结核性胸膜炎病人有自愈的倾向,因此,结核性胸膜炎是研究结核感染局部免疫应答的良好模型。研究提示,结核感染局部Th1型细胞因子水平和抗原特异性CD4+T细胞频率显著高于外周血,这是否与结核性胸膜炎的自愈倾向相关,目前还不清楚。因此,本研究集中探讨了结核感染局部结核抗原特异性CD4+T细胞的表型、功能和调节因素及其机制,期望为新型结核疫苗的研发、结核的诊断和治疗提供新的思路。此外,目前对于结核抗原特异性CD4+T细胞的检测和鉴定大多依赖于细胞因子的产生,这并不能代表所有抗原特异性CD4+T细胞,为此,本课题对于结核感染局部抗原特异性CD4+T细胞的鉴定也进行了探索,取得了初步的成果。本研究的目的在于:　　 1.比较结核性胸膜炎病人结核感染局部与外周血结核抗原特异性T细胞水平,探讨结核感染局部抗原特异性Th1细胞的表型和细胞因子产生,并对于Th1细胞进行多功能分析;　　 2.分析结核抗原特异性Th细胞的表型、功能和调节机制,阐明结核抗原特异性Th细胞的数量和质量与疾病进展的相关性。　　 3.寻找结核抗原特异性Th细胞的标志,为结核的早期诊断提供理论依据,为结核的预后和转归提供新的评价指标;　　 为了实现上述目标,该论文进行了较为系统的研究,结果分为以下三个部分:　　 第一部分:结核性胸膜炎病人胸水中结核抗原特异性多功能性Th1细胞表型及功能分析;　　 我们首先比较了结核性胸膜炎病人胸水细胞(PFCs)和外周血单个核细胞(PBMCs)经不同结核抗原(BCG,ESAT-6/CFP-10多肽)刺激后产生IFN-γ、IL-2和TNF-α的水平。结果表明,PFCs产生IFN-γ、IL-2和TNF-α的水平显著高于PBMCs;流式分析表明,IFN-γ、IL-2和TNF-α主要由CD4+T细胞分泌,且PFCs中Th1细胞频率显著高于PBMCs。我们进一步分析了ESAT-6/CFP-10混合多肽中诱导细胞因子产生的单肽,结果发现,对于每一个体,细胞因子主要由1-2条单肽诱导产生,证明这些单肽是刺激细胞因子产生的优势表位,但在不同个体间存在差异。我们又分析了细胞因子组成,发现BCG刺激后Th1细胞以分泌IFN-γ为主,而经ESAT-6和CFP-10混合多肽刺激后,分泌IL-2和/或TNF-α的Th1细胞频率高于仅分泌IFN-γ的Th1细胞,表明不同抗原诱导产生的Th1细胞在细胞因子分泌种类上存在差异。依据抗原特异性Th1细胞分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的不同,Th1细胞可分为七个亚群,其中,可同时分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的细胞为多功能性Th1细胞。我们发现,ESAT-6/CFP-10多肽特异性多功能性Th1细胞的频率显著高于BCG特异性多功能性Th1细胞,且前者在单细胞水平上表达IFN-γ、IL-2和TNF-α的水平显著高于后者。这表明,不同结核抗原特异性多功能性Th1细胞的数量和质量均存在差异。表型分析表明,抗原特异性Th1细胞为效应型记忆细胞(CD4+CD45RA-CD62L-CCR7-CD2T)。此外,BCG和ESAT-6/CFP-10多肽对于细胞因子产生和细胞分裂均具有叠加效应。BCG或ESAT-6及CFP-10多肽分别刺激表达不同T细胞受体Vβ链的Th1细胞发生增殖。　　 第二部分:结核性胸膜炎病人胸水中CD4+CD69+T细胞的表型、功能及抗原特异性研究。　　 我们发现,结核性胸膜炎病人胸水中CD4+T细胞表达CD69水平显著高于结核病人及正常人外周血单个核细胞。CD4+CD69+T细胞表达活化分子HLA-DR水平也显著高于CD4+CD6VT细胞,但表达CD25的水平与CD4+CD69-T细胞无显著差异。此外,CD4+CD69-T细胞的百分比与胸水中淋巴细胞数量成反比,与胸水中ADA水平成正比,而与总蛋白水平无显著相关性。进一步分析并比较CD4+CD69+/CD4+CD69T细胞Th1转录因子T-bet的表达,结果发现,CD4+CD69+T细胞绝大部分表达T-bet(＞95％),为Th1细胞表型特征,显著高于CD4+CD69-T细胞(P＜0.01)。为了进一步确定CD4+CD69+T细胞为Th1细胞,我们又分析了CD4+CD69+/CD4+CD69-T细胞IL-12Rβ2的表达,结果表明,CD4+CD69+T细胞表达IL-12Rβ2水平显著高于CD4+CD69-T细胞。进一步检测了CD4+CD69+/CD4+CD69-T细胞Th1细胞因子(IFN-γ、IL-2和TNF-α)的表达,结果表明,IFN-γ、IL-2和TNF-α主要由CD4+CD69+T细胞分泌,而CD4+CD69-T细胞极少或不分泌上述细胞因子,CD4+CD69+T细胞表达Th1细胞因子水平显著高于CD4+CD69-T细胞(P＜0.001)。进一步对于CD4+CD69+T细胞进行多功能分析表明,CD4+’CD69+T细胞主要由多功能性Th1细胞组成,即同时分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的多功能性Th1细胞的百分比显著高于仅分泌两种或一种细胞因子的Th1细胞,而CD4+CD69-T细胞和CD4+T细胞均主要由仅分泌一种细胞因子的Th1细胞构成。CD4+CD69+T细胞的表型主要为CD45RA-CD45RO+CD2T记忆性细胞特征。CD4+CD69+IFN-γ+细胞也主要为CD45RA-CCR7-CD62L-CD27-效应型记忆细胞。为了直接证明CD4+CD69+T细胞为抗原特异性细胞,我们分别分选出CD4+CD69+和CD4+CD69-T细胞,以CD14+细胞作为抗原提呈细胞,分别与BCG或ESAT-6/CFP-10多肽共培养。ELISA检测培养上清中IFN-γ、IL-2和TNF-α的水平,结果表明,CD4+CD69+T细胞分泌细胞因子水平显著高于CD4+CD69-T细胞。流式结果表明,IFN-γ、IL-2和TNF-α仍主要由CD4+CD69+T细胞分泌,而CD4+CD69-T细胞基本不分泌上述细胞因子。进一步分别分选出CD4+CD25+和CD4+CD69+T细胞,我们证明了CD4+CD25+细胞以剂量依赖方式抑制CD4+CD69+T细胞细胞因子的产生。　　 第三部分:结核性胸膜炎病人胸水中CD4+CD40L+T细胞的表型、细胞因子产生及抗原特异性研究。　　 我们发现,结核特异性抗原ESAT-6/CFP-10多肽刺激结核性胸膜炎病人胸水细胞后,可特异性诱导CD4+T细胞表达CD40L,而CD8+T细胞几乎不表达CD40L。此外,正常人外周血单个核细胞经结核特异性抗原刺激后,CD4+T细胞极少或不表达CD40L,证明了CD40L特异性表达于抗原特异性CD4+T细胞。进一步检测了CD4+CD40L+T细胞表达细胞因子类型及水平,结果表明,经结核特异性抗原刺激后,CD4+CD40L+T细胞表达大量Th1细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-α,几乎不表达Th2细胞因子IL-4和IL-10,但表达IL-17和IL-22。CD4+CD40L+T细胞表达上述细胞因子百分比显著高于CD4+CD40L-T细胞。分泌Th1细胞因子(1FN-γ、IL-2或TNF-α)的CD4+T细胞表达CD40L水平显著高于不分泌任何Th1细胞因子(IFN-γ、IL-2或TNF-α)的CD4+T细胞(P＜0.001)。进一步分析CD4+CD40L+T细胞的多功能性,结果表明,CD4+CD40L+T细胞主要为同时分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的多功能性T细胞,多功能性T细胞百分比显著高于仅分泌两种或一种细胞因子的细胞。表型检测表明,CD4+CD40L+T细胞主要为CD45RA-CD45RO+CD62L-CCR7-效应型记忆细胞,同时表达一定水平的活化分子CD69和HLA-DR,但不表达CD25和ICOS。为了证实CD4+CD40L+T细胞的抗原特异性,分别分选出CD4+CD40L+/CD4+CD40L-T细胞和CD14+细胞(作为抗原提呈细胞),再次与ESAT-6/CFP-10多肽共培养后,流式分析表明,IFN-γ、IL-2和TNF-α仍主要由CD4+CD40L+T细胞所分泌,且显著高于CD4+CD40L-T细胞分泌细胞因子水平。ELISA检测细胞培养上清中细胞因子水平,发现CD4+CD40L+T细胞分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-17和IL-22水平显著高于CD4+CD40L-T细胞。　　 本研究的结论和创新之处:　　 1.发现结核性胸膜炎病人胸水中结核抗原特异性CD4+T细胞频率显著高于结核病人外周血,不同结核抗原特异性多功能性CD4+T细胞的数量和质量均存在差异;　　 2.结核性胸膜炎病人胸水中CD4+T细胞表达CD69水平显著高于正常人及结核病人外周血,且CD4+CD69+T细胞主要为结核抗原特异性多功能性效应型记忆性Th1细胞。　　 3.结核性胸膜炎病人胸水中CD4+T细胞经结核抗原刺激后特异性表达CD40L,CD4+CD40L+T细胞主要为多功能性效应型记忆性Th1细胞、Th17或Th22细胞。CD40L可作为结核抗原特异性Th细胞的标志。　　 该研究为深入了解结核感染局部结核抗原特异性T细胞的表型和功能特征提供理论依据,为检测结核抗原特异性Th细胞提供指导,为全身性结核的早期诊断和治疗、新型结核疫苗的设计和评价提供指导。